分子实验室、细胞实验室常用配方.docx

分子实验室、细胞实验室常用配 方（一）WB相关试剂及常用缓冲液• RIPA (100mI)(最后要调pH为7.4)终浓 度Tris-HCI(pH7.4 )50m MNaCI150 mMTritonX-1001%脱氧胆酸钠1%EDTA1 mMSDS0.1%PMSF (100mM)分子量称取121.14605.7mg58.44876.6mg1mI1g292.24 829.2248m g0.1g使用时每1ml 加 10ul• 10%过硫酸铵溶液AP （分装保存于-20度）AP粉末 1gddH 0 10ml2• 10%SDS （十二烷基硫酸钠）：10g100mlSDS粉末ddH 0定容到注意：用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡• 6X 蛋白质 sample bufferTris-HCl（1 虬 pH6.8）30mLSDS 10g甘 油30mLDTT（154.25） 9.3gIII漠 0.06g dd H0 2 容至100mL• 10XPBS缓冲液的配制：80g 2gNaCl KClNa2HPO4 14.4g （十二水合36g） 2KH2PO40 2.4g加800 mLddH O,根据开始的pH用NaOH或HCL调 2pH到7.4,调好pH再定容到1升。

配好后用高 压蒸气灭菌后常温保存最好是在4度• PBST(1X)PBS(1X)Tween 20500ml500 ul成分的用量i=jTris粉末冰醋酸Na2EDTA • 2H2O ddH 0定容到2•封闭液脱脂奶粉叠氮钠242g57.1ml37.2g 1L5g0.02g(现配现用时可不加）PBS定容到100mL•染色液（室温）1L500ml200ml100ml甲醇500mL25010050乙酸100 mL502010R250考马斯亮蓝0.5g0.250.1 g0.05• 50XTris-乙酸（TAE）缓冲液配制1L溶液各ggH02400 mL2008040•■脱色液：（室温）甲醇165mL乙酸50 mLH0785 mL2• 8.8Buffer:（调 pH 至 8.8,4 度保存）100ml200mlTris18.17g36.34g10%SDS4mL8mlddH02定容至100mL200ml• 6.8 Buffer:（调 pH 至 6.8,4 度保存）100ml200mlTris6. 06g12.12g10%SDS4mL8mlddH02定容至100mL200ml1L2L甘氨酸144g288gTris 粉 末30.3g60.6ddH02定容至1L定容至2L•转移缓冲液（10Xtrans buffer）：（常温保 存）使用时甲醇 ' '200mL转移缓冲液（10X） 100 mLddH 0 700 mL2•电泳缓冲液（10X） （running buffer）：（常 温保存）1L2L甘氨酸144g288gTris 粉 末30.3g60.6SDS10g20gddH02定容至1L定容至2L10X)TBS:（常温保存）NaCl 80.0g24.2g定容至1LTris粉末ddH02• TBST(1X)TBS(1X)Tween 20500ml500 ul• Stripping buffer(可反复利用)温老师组配方10ml350 l6.25ml (6.06 加到 50mL至 50mL10%SDSB-巯基乙醇Tris-HCI（pH6・8） 水） 加入ddH O 2方 甘氨酸 SDS Tween20 dd ddHO2• Stripping buffer（可反复利用）郭老师给配15g1g1ml1L作这个buffer洗20min,然后用PBST洗3次， 再重新封闭孵抗体。

二）细胞和细菌培养基、抗生素• LB培养基（当天灭菌后放4度存放）1000ml500ml300 ml250 ml200 ml氯化HTrl Ki钠10g5g3g2.5g2g蛋白 胨10g5g3g2.5g2g酵母提取物5g2.5g1.5g1.25g1gddH02定容至定容至定容定容至定容1000ml500ml至300ml250ml至200ml• LB平板：（当天灭菌后倒平板1，放4度存放）1000ml500ml300 ml250 ml200 ml氯化10g5g3g2.5g2g钠蛋白 胨10g5g3g2.5g2g酵母 提取 物5g2.5g1.5g1.25g1g琼脂15g7.5g4.5g3.725g3gddH02定容至1000ml定容至500ml定容 至 300ml定容至250ml定容 至 200mlSOB培养基将下列组分溶解在0.9L水中：蛋 白 胨20g酵母提取物 5 g 0.5g1mol/L 氯化钾2.5ml用水补足体积到1L分成100ml的小份，高压 灭菌培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁叨用-%(^pm滤器过滤• Amp+(50mg/ml)代-B-D-半乳糖苷(分子 菌，分装成定精份贮存注意用分装保存• Kana+(50mg/ml)I1000： 1 的比例用分装保存于ana/，使用时按明。

」的•胰酶：抽滤，长期保存可放负20度粉末 0.25gEDTA 0・02-0・03g1XPBS 100ml粉末碳酸氢钠ddH02调 pH 值到：7.2-7.4)•高糖DMEM培养基：抽滤保存在4度全部3.7g定容到1L (用盐酸• G418 母液（100mg/ml）用 0.22pM 滤菌，分装 存于-20度粉末 1gPBS 10ml• zeocin 母液（100mg/ml）用 0.22pM 滤菌，分 装存于-20度粉末 1gddH2O 10ml• Blasticidin（100mg/ml）用 0.22pM 滤菌，分装存于-20度粉末 0.3gPBS 10ml（三）利用His-tag从细菌中纯化蛋白配方透析液配方终浓度母液浓 度量取体 积Tris-HCl(pH:8.0)20mM1M20mlNaCl20mM4M5 mlMgCl22mM1M2 mlDTT1mM1M1 ml甘油50%500 mlddHQ2472 ml超声裂解液（lysis buffer） .:2011年做蛋白纯化时用Na3PO4 (164) 8.2g (50mM)NaCl (58.5) 17.55g(300mM)加800 mL ddH O溶解，用2M NaOH或者22M HCL调pH到8.0，再定容到1升。

配好后用 高压蒸气灭菌后常温保存III洗涤液（wash buffer）• : 2011年做蛋白纯化时用Na3PO4 8.2g（50mM）NaCl 17.55g （300mM）咪唑 0.681g（10mM）加800 mLddH O ,根据开始的pH用2M NaOH或2 溶解者2M HCL调pH到8.0，调好pH再定容到1升•洗脱液(elution buffer):2011年做蛋白纯化时用Na3PO4 8.2g (50mM)NaCl 17.55g (300mM)咪唑 17.025g (250mM)加800 mLddH2O溶解，根据开始的pH用2MNaOH 或者 2M HCL 调 pH 到 8.0，调好 pH再定容到1升)PrepEase®Histidine-Tagged ProteinPurification Kits - High Speci ficity• 8X LEW Buffer (Lysis-Equilibrium-WashBuffer):(室温保存)pH： 8.0NaH2PO4.2H2O 6.2404g(400mM)NaCl 14.0256g (2.4M)dH 0 定容到 100 mL2(调节 pH： 8.0)• 4X Elution Buffer:(室温保存)pH： 8.0NaH2PO4.2H2O 3.1202 g(200mM)NaC l7.0128g(1.2M)咪唑6.81 g (1M)dH02（调节 pH： 8.0）定容到100 mL• EDTA: （100mM）EDTAdH 022.923 g定容到100 mL• NiSO :4NiSO4.6HO22.6285g（100mM）定容到100 mL•溶菌酶:dH 02（使用时1ml溶液加入20ul）粉末 50mgddH201mL（四）利用His-tag从细胞中富集蛋白配方•磷酸钠缓冲液按图示比例混合0・2 M Na HPO溶液和0・2 2 4MNaHPO溶液，得到两种缓冲液，pH分别调节成 24为8.0和6.3.pH0.2 M Na2HPO4体积 /mL0.2 MNaH2PO4 体积 /mL6.311.2538.758.047.352.65•细胞裂解华液（最好新鲜配制，当天使用）Cell lysis buffer终浓度配10ml配15ml配20ml配40ml配30ml盐酸胍（g）6M5.73188.597711.463622.927217.1954冲液pH必须8.0!）（注意二价阳离子螯合剂，还原剂，会导致镍从 树脂上的洗脱）本实验的所有试剂中EDTA浓度不得超过1mM,DTT浓度不超过5 mM，巯基乙醇浓度不超过20mMopH 8.0的洗脱溶液（最好新鲜配制，。