DMT1在MPPltgt和6OHDA导致的MES235细胞内铁聚积中的作用研究.pdf

D M T l 在M p p + 和6 - O H D A 导致的M E S 2 3 ．5 细胞内铁聚积中的作用研究摘要帕金森病( p a r k i n s o n ’sd i s e a s e ，P D ) 是继阿尔茨海默病之后的第二大神经系统退行性疾病在我国患帕金森病的病人已达1 7 2 万、5 5 岁以上的人群帕金森病的患病率接近1 ％随着老龄化社会的到来，P D 已成为一个沉重的话题由于该病的确切病因和发病机制尚不清楚，目前只能是对症治疗，无法从根本上治疗P D 并延缓其进展，因此，深入探讨P D 的发病机制成为医学界迫在眉睫的话题铁在P D 的发病过程中起着关键的作用，过量的游离铁，特别是F e 2 + 可以通过F e n t o n 反应形成羟自由基( h y d r o x y lr a d i c a l ，O H ·) ，O H ·通过损伤蛋白质、核酸、和含有大量未饱和脂肪酸的细胞膜，最终导致细胞死亡目前已有大量的证据表明凋亡也参与了P D 的发病过程在P D 的发病过程中，黑质( s u b s t a n t i an i g r a ，S N ) 内过多的铁的异常沉积可能是导致多巴胺神经元死亡的关键因素。

但是，是什么原因导致S N 内铁聚集目前还不清楚由于经典的转铁蛋白／转铁蛋白受体途径在P D 中没有改变，因此，我们拟研究新发现的铁转运蛋白，二价金属离子转运蛋白l ( d i v a l e n tm e t a lt r a n s p o r t e rl ，D M T l ) 在P DS N 铁聚积中的作用本实验应用两种经典的神经毒性药物1 ．甲基．4 苯基吡啶离子( 1 - m e t h y l ．4 ．p h e n y l ．p y r i d i m ，M P P + ) 和6 羟基多巴胺( 6 ．h y d r o x y d o p a m i n e , 6 - O H D A ) ，应用W e s t e r nb l o t s 、实时荧光定量P C R 、流式细胞术技术、激光共聚焦显微镜等多种综合技术，观察其对D M T l 的表达以及细胞摄铁能力的影响，并深入讨论其机制结果如下：1 ．M P P + ( 5 p m o ㈣处理M E S 2 3 ．5 细胞2 4 h ，可以增加细胞对F e 2 + 的摄取，与对照组相比差别有统计学意义( P 茹o西曙4田喀。

D M T l 的表达上调参与了M P P + 诱导的M E S 2 3 ．细胞的凋亡如表1 ．3 所示，D M T I ( - I R E ) m R N A 表达上调了1 倍，而D M T I ( + I R E ) m R N A 表达没有变化这提示M P P + 处理M E S 2 3 ．5 细胞可上调D M T I ( ．I R E ) 的蛋白和m R N A C f ) n Ir o l■■■●■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■_ F e工上广] 工‘●c n t r o IF e 2 + M P P ．D F o 警吖器知图1 ．5 ．不同药物处理导致细胞核形态的改变F i g1 ．5 ．M o r p h o l o g i c a lc h a n g e si nt h en u c l e io fM E S 2 3 ．5c e l l sw i t hd i f f e r e n tt r e a t m e n t s ．C e l l si nM P P + ／F e 2 + g r o u ps h o w e dh y p e r c o n d e n s e dn u c l e a r , w h i l eo t h e rg r o u p ss h o w e dn oc h a n g e si nn u c l e a rm o r p h o l o g y ．M a g n i f i c a t i o n4 0 0 x ．’P ∞一《Z芷I．c工。

氐《o、协屯叱一-oo 口嚼叱青岛大学硕士论文运用该细胞系得出的实验结果可以给出P D 神经退行性变的直接证据M P T P 是一种经典的神经毒性药物，它可选择性的损伤人类和其它灵长类动物的S N ，造成急性的p D [ 4 8 , 5 1 , 5 2 1 M P T P 处理的动物表现P D 的主要标志，包括S ND A 神经元的丢失另外，M P T P 导致的氧化应激在D A 能神经元退变中起着重要作用M P T P 被胶质细胞的M A O - B 氧化成M p p + D A O 酹0 经元通过D A T 将M P P + 摄取入细胞内，并选择性的损伤线粒体功能，导致细胞死亡另有证据表明铁也参与了M P T P 的神经毒性作用在溶液中高水平的铁本身可以催化M P T P 自身氧化成M P P + ，产生H 2 0 2 和O H ·，导致细胞死亡【5 1 5 3 本实验室前期的工作也证明了，M P T P 制备的P D ／J ' 鼠模型的S N 内铁的聚积1 2 4 1 但是，铁选择性的聚积在S N 的原因，铁进入细胞的途径仍不清楚虽然也有证据提示T 侬途径在M P P + 导致的细胞摄铁增多中起重要作用，但仍需进一步证实，因为，T f R 转运的是F e 3 + 。

但是，机体内F c 2 + 的毒性远远大于F e 3 + 目前已知的F e 2 + 转运体只有D M T l ，因此，我们检测了M P P + 处理的M E S 2 3 ．细胞内D M [ T l 的表达我们发现D M T I ( ．m E ) 而不是D M T l ( + I R E ) 表达上调运用实时荧光半定量P C R 的方法证实，其表达的上调是在转录水平实现的M P P + 处理后，I R P l 的m R N A 表达没有变化，而I R P 2 m R N A 表达下调提示M p p + 不能激活I R P 为了防止铁的氧化反应对细胞造成损伤，参与铁转运和存储的蛋白受到细胞内铁水平的精密调节该调节是I m P s 结合特异性的蛋白的I R E 进行的转录后调节【降5 6 】在哺乳动物细胞内，I R P l 具有顺乌头酸酶的活性，而I R P 2 是铁水平的主要的感受体细胞内增加的铁可能是I R P 2表达下调的原因I R P 2 表达降低，不能同T 瓜m R N A 3 ' - U T R 和铁蛋f l m R N A 5 ’．U T R 的I R E 结合，导致T f R m R N A 降解加快，T f R 表达下调，转铁蛋白表达上调【5 1 7 1 。

这可能是机体的保护性机制，防止过多的铁聚积虽然，D M T l 的m R N A 的3 ’- U T R 包含一个I R E ，有研究表明其与位于T f R m R N A 的I R E 类似，但是，其功能尚待明确，并且受到质疑【5 8 1 D M T I ( + I R E ) 的表达并没有受到I l 冲表达下调的影响这同他人的研究是一致的K c等人研究发现不同年龄的对大鼠脑内不同脑区D M T l 不同亚型的表达的变化有影响，但脑内铁的水平对两种亚型的D M T l 表达没有影响【2 4 】但在小肠内，D M T I ( + I R E )的m R N A 和蛋白的表达受到机体铁水平的负调节在肝细胞内，D M T l ( + I I 迮) 的蛋白的表达受到机体铁水平转录后的正性调节【5 9 】这一问题存在这争议，因此，有必要做进一步的研究由于D M T l ( ．I R E ) 的m R N A 的3 ' - U T R 并不包含I R E ，因此它的调节机制并不清楚，可能存在着其它调节D M T l m R N A 表达的机制在D M T l 的5 ’调节区域有两个C C A A T 盒，但没有T A T A 盒，有五个金属反应元件，三个潜在的S P l 结合位点和一个Y ．干扰素调节元件【2 引。

要深入了解其调节机制，尚需进行更进一步的研究细胞内过多的F e 2 + 与H 2 0 2 反应生成O H ·，进一步损伤线粒体，我们的实验证实了这一点众所周知，线粒体功能损伤在凋亡中起着关键作用‘细胞色素C 通过不同途径，从受损的线粒体内释放出来，激活效应c a s p a s e ，c a s p a s e - 3 ，c a s p a s e - 3 切割P A R PD M T l 的表达上调参与了M p p + 诱导的M E S 2 3 ．细胞的凋亡激活内源性核酸酶，导致D N A 的片段化[ 6 0 - 6 2 1 本实验中发现，铁离子螯合剂D F O 可以完全阻断铁诱导的凋亡，进一步证实了铁的毒性作用这以结果同其他学者的研究是一致的【6 3 1 M P l l P 制备的小鼠P D 模型全身给予铁离子螫合剂，可以阻止S ND A f l 邑神经元的进行性的损失【5 3 1 有一篇报道阐明了M 3 0 可以降低M P T P 制备的大鼠P D 模型S N内D A 能神经元的丧失，增加纹状体内D A 、五羟色胺、肾上腺素的含量，这可能是M 3 0 螯合了M P T P 导致的S N 内增多的铁的原因。

M 3 0 兼有铁离子螯合剂和M A O ．B 抑制剂的作用例2 5青岛大学硕士论文第二章D M T l 在6 - O H D A 导致的M E S 2 3 ．5 细胞内铁聚积中的作用研究摘要目前已经有足够的数据证明了铁在P D 的发病过程中起着重要的作用，过量的游离铁，特别是F e 2 + 可以通过F e n t o n 反应形成O H ·，O H ·通过损伤蛋白质、核酸和含有大量未饱和脂肪酸的细胞膜，最终导致细胞死亡本实验室前期工作中已证实在6 - O H D A 制备的P D 大鼠模型中，D M T l 在S N 内表达增高，D M T l 的表达增加是否导致了S N 内铁聚积的原因呢? 因此，我们运用6 - O H D A 处理的M E S 2 3 ．5 细胞，探讨了D M T l 在6 - O H D 处理的M E S 2 3 ．5 细胞中铁聚积的作用，并对其机制做了进一步研究结果发现：l6 - O H D A ( 1 0 “m o l ／L ) 处理M E S 2 3 ．5 细胞2 4 h ，可以增加细胞对F e 2 + 的摄取，与对照组相比差别有统计学意义( R 0 ．0 1 ) ，铁孵育后，细胞的△、壬，m 降低，细胞内R O S生成增加，c a s p a s e ．3 激活，细胞核发生固缩。

上述改变可以被D F O 所阻断26 - O H D A ( I 上m o l ／L ) 处理M E S 2 3 ．5 细胞2 4 h ，D M T1 ( + Ⅱ辽) 蛋白表达增高，其m R N A表达也增高，但D M T I ( ．m E ) 的表达未观察到变化36 - O H D A ( 1 0 } ．t m o l ／L ) 处理的M E S 2 3 ．5 细胞内I R P l 和I R P 2m R N A 及蛋白的表达均上调4 成功构建携带干涉I R P l 和I R P 2 干涉序列的质粒，p S i l e n c e r l ．0 U 6 ．I R P l ．1 、p S i l e n c e r l ．0 U 6 ．I R P l - 2 、p S i l e n c e r l ．0 U 6 ．I R P 2 - 1 、p S i l e n c e r l ．0 U 6 - 1 R P 2 ·2 经R T - P C R筛选出p S i l e n c e r l ．0 U 6 ．I R P l ．1 和p S i l e n c e r l ．0 U 6 ．I R P 。