氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量.pdf

实验二 . 氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量093858 张亚辉一. 实验目的1. 学习荧光分析法的基本原理和LS－55B发光分析仪的操作2. 学习同步荧光的操作，了解同步荧光的优点二. 实验原理荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析在一定光源强度下，若保持激发波长ex不变，扫描得到的荧光强度与发射波长em的关系曲线，称为荧光发射光谱；反之，保持em不变，扫描得到的荧光强度与ex的关系曲线，则称为荧光激发光谱在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比， 这是荧光定量分析的基础 荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关酪氨酸(Tyr) 、色氨酸（ Try） 、苯丙氨酸（ Phe）是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分， 可以用荧光分析法测定 它们的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，提高选择性三. 实验仪器和试剂1. LS-55 型发光谱仪 ; 2. 移液枪 ( 德国 BRAND 公司生产 ); 3. 100ml 容量瓶 2 支; 废液池（烧杯）一只；4. 氨基酸储备液：色氨酸20mg/l ，苯丙氨酸 20mg/l. 双酚 A; 5. 去离子水 ; 四. 实验步骤1．打开电脑和光谱仪主机， 将仪器预热 20 分钟左右。

设定仪器参数： 全波长预扫描参数， 用储备液在 100ml 容量瓶中配置溶液， 加水定溶后， 使得色氨酸浓度为 0.1mg/l, 苯丙氨酸 1mg/l ；对两种溶液进行预扫描，并记录扫描结果同时查看其拉曼波长、瑞利散射波长、以及双倍频峰波长2．从预扫描得到激发和发射波长的初步结果（200 – 600nm ） ，分别对两种氨基酸溶液测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱激发光谱参数：扫描波长范围200 - 350nm em(Phe)=287nm， 扫描速度=500nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm,记录信息；em(Try)=357nm, 扫描速度=500nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm,记录信息发射光谱参数：扫描波长范围200 - 400nm ；λex（Phe）=206nm, 扫描速度=500 nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm, 记录信息； λex(Try)=217nm, 扫描速度=500 nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm,记录信息记住取文件名同步荧光光谱：扫描波长范围200-350nm, Δλ(em-ex) （Phe）=81nm,扫描速度 =500nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm,记录信息；Δλ(em-ex)（Try）=140nm,扫描速度 =500nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm。

注意：由于物质的荧光性质受许多条件的影响，以上实验参数仅供参考，具体参数的选择视实际情况而定 ）五．数据处理1．用实验获得的数据绘制双酚A的激发、发射、同步光谱图双酚A-10001002003004005006007008000100200300400500600波长/nm发射激发 同步2．从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高双酚 A扫描激发波长在230nm和 280nm两处出现最高峰，本实验选择230nm为最大激发波长此外，激发波长曲线在300－320nm处出现了一个十分完美的峰，请注意，此峰由瑞利散射而产生，非激发波长峰3. 改变狭缝宽度，观察曲线有什么变化？狭缝宽度从 5mm 增大到 10mm 时，检测信号明显增强；而当狭缝增大到一定范围时，检测到的信号强度不再变化500501001502002503000100200300400500600同步狭缝5 同步狭缝 10 同步狭缝 500六．讨论与思考1．对待测溶液进行预扫描的有何作用？从预扫描可以得到激发和发射波长的初步结果，利用我们得到的初步结果对参数进行设置，然后再测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。

2．观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？激发波长的整数倍处荧光发射光谱出现很强的倍频峰，该波长不适合于进行定量分析3．同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因同步荧光技术能简化光谱，减少光谱重叠和散射的影响，对荧光性质相近的 化合物能提高测定的选择性和灵敏度同步荧光法相对于激发和发射光谱，得到 的峰比较窄， 更明显同步荧光光谱固定波长差，同时扫描激发光谱和发射光谱 重叠波长处，同时产生信号 例如，丁省在 450~500nm激发光谱与发射光谱重叠， 而同步荧光有较好的选 择性，清晰地显示出光谱丁 省 － 普 通 荧 光丁 省 － 同 步 荧 光4．通过两种氨基酸的化学结构， 是否可以不经试验判断其荧光强度的大小次序CH2CHCOOHNH2CNHCH2CHCHCOOHNH2苯丙氨酸色氨酸从共轭角度看，体系的共轭度增强，荧光效率一般也增大这是由于增大了荧光物质的摩尔吸光系数，π电子更容易被激发， 产生了更多的激发态分子，使荧光增强苯丙氨酸有4 个共轭双键，而色氨酸有5 个共轭双键，所以色氨酸的荧光强度大于苯丙氨酸的荧光强度。

5．比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点1) 仪器: 紫外分光光度计荧光仪2) 原理: 紫外分光光度法 通过被测物质在紫外光区（200-760nm ）的特定波长或一定波长范围内光的 吸光度 , 对该物质及进行定性和定量分析 朗伯比尔定律A=kbc （A为吸光度， k 比例常数， b 为液层厚度， c 为溶液浓度） 荧光分析法利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法3）优缺点： 紫外分光光度法 提供的信息量比较少，虽然可以提供化合物的骨架结构和验证某些发色基 团，但很难确定基团位置 荧光分析法 影响因素 分子结构 首要条件有吸收，含共轭双键，通常>1 个苯环 刚性平面结构减少振动和碰撞去活 给/ 吸电子基增 / 减荧光 卤素重原子效应荧光大减 环境因素 激发态比基态极性大，溶剂极性增，则荧光红移并增强 温度对其影响非常大辐射跃迁与T几乎无关，非辐射随T显著增大 对有机弱酸碱物质影响大，不同型体情况不同 猝灭效应 (1) 碰撞猝灭及能量转移： 主要是外部转换热效应，溶剂或溶质分子间发生物理或化学作用导致荧光强 度下降 (2) 氧熄灭 顺磁性氧分子，促系间跨跃成三重态 (3) 自熄灭 / 自吸收 自熄：浓度高时，激发态之间相互碰撞 自吸：荧光与吸收曲线重叠，又被基态分子吸收七．讨论与体会由于之前实验操作人员没有将比色皿洗干净，导致我们对两种氨基酸的荧光 光谱测定没有成功。

按理说，自来水的荧光光谱应该是一条水平线，但我们做了 几次都得到下面的光谱，看来杂质的影响比较严重 我们要以此为戒，实验前不仅要认真的做好实验，实验后更要清理好仪器， 养成良好的实验习惯。