【最新】Northern blot技术.doc
9页
核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot ）（一）Southern Blot 原理： 将待检测的 DNA 分子用 /不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的 DNA或 RNA 探针进行反应如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…（一）Southern Blot 原理： 将待检测的 DNA 分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的 DNA 或 RNA 探针进行反应如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小 用途：检测样品中的 DNA 及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等 （二）Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的 RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot 相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量 （三）探针标记技术1 标记物：放射性和非放射性两种放射性： 非放射性：生物素、地高辛素、荧光素 2、标记方法 （1）切口平移法 （2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链 DNA 探针标记（5）寡核苷酸探针标记法 northern blot简 介Northern blot 是 一 种 通 过 检 测 RNA 的 表 达 水 平 来 检 测 基 因 表 达 的 方 法 ，通 过 northern blot 的 方 法 可 以 检 测 到 细 胞 在 生 长 发 育 特 定 阶 段 或 者 胁 迫 或 病理 环 境 下 特 定 基 因 表 达 情 况 Northern blot 首 先 通 过 电 泳 的 方 法 将 不 同 的 RNA 分 子 依 据 其 分 子 量 大小 加 以 区 分 ， 然 后 通 过 与 特 定 基 因 互 补 配 对 的 探 针 杂 交 来 检 测 目 的 片 段 Northern blot”这 一 术 语 实 际 指 的 是 RNA 分 子 从 胶 上 转 移 到 膜 上 的 过 程 ， 当然 它 现 在 通 指 整 个 实 验 的 过 程 。
Northern blot 在 1977 年 由 斯 坦 福 大 学James Alwine， David Kemp 和 George Stark 发 明 Northern blotting 实 际 上依 照 比 它 更 早 发 明 的 一 项 杂 交 技 术 Southern blot（ 依 据 生 物 学 家 EdwinSouthern 名 字 来 命 名 ） 来 命 名 ， Southern blot 主 要 用 来 对 DNA 进 行分 析 流 程首 先 需 要 从 组 织 或 细 胞 中 提 取 总 RNA ,或 者 再 经 过 寡 聚 （ dT） 纯 化 柱 进行 分 离 纯 化 得 到 mRNA 然 后 RNA 样 本 经 过 电 泳 依 据 分 子 量 的 大 小 对 被 分离 ， 随 后 凝 胶 上 的 RNA 分 子 被 转 移 到 膜 上 膜 一 般 都 带 有 正 电 荷 ， 核 酸 分子 由 于 带 负 电 荷 可 以 与 膜 很 好 的 结 合 转 膜 的 缓 冲 液 含 有 甲 酰 胺 ， 它 可 以 降低 RNA 样 本 与 探 针 的 退 火 温 度 ， 因 而 可 以 减 少 高 温 环 境 对 RNA 降 解 。
RNA 分 子 被 转 移 到 膜 上 后 须 经 过 烘 烤 或 者 紫 外 交 联 的 方 法 加 以 固 定 被 标 记的 探 针 与 RNA 探 针 杂 交 ， 经 过 信 号 显 示 后 表 明 需 检 测 的 基 因 的 表 达 Northern blot 实 验 中 阴 性 对 照 可 以 采 用 已 经 过 RT-PCR 或 基 因 芯 片 检 测 过 的无 表 达 的 基 因 材 料电 泳 胶Northernblot 中 最 为 常 用 的 电 泳 胶 是 含 有 甲 醛 的 琼 脂 糖 凝 胶 ， 甲 醛 可 以减 少 RNA 的 二 级 结 构 ， 电 泳 完 成 后 的 胶 可 经 过 EB 染 色 后 在 紫 外 下 检 测RNA 的 质 量 而 对 小 分 子 的 RNA 或 者 microRNA 一 般 采 用 聚 丙 烯 酰 胺 变 性胶 电 泳 RNA 电 泳 中 可 以 依 据 核 糖 体 RNA 的 大 小 大 致 判 断 条 带 的 大 小 ，28S RNA 大 小 一 般 为 5kp， 18S RNA 大 小 一 般 为 2k 28S RNA 的 亮 度 一 般是 18S 的 两 倍 。
探 针Norther blot 中 探 针 的 序 列 需 要 和 检 测 目 的 基 因 序 列 互 补 配 对 ， 探 针 可 以是 DNA、 RNA 或 者 其 它 的 寡 聚 核 苷 酸 ， 但 最 小 的 长 度 必 须 大 于 25bp， 体 外合 成 的 RNA 探 针 可 以 采 用 更 高 的 退 火 温 度 来 减 少 背 景 中 的 噪 音 探 针 一 般 采用 P 或 者 地 高 辛 来 进 行 标 记 杂 交 过 后 ， 可 采 用 X 胶 片 显 色 的 方 法 来 检 测信 号 应 用Northern blot 可 用 来 检 测 不 同 组 织 、 器 官 ； 生 物 体 不 同 发 育 阶 段 以 及 胁迫 环 境 或 病 理 条 件 下 特 定 基 因 的 表 达 样 式 如 northern blot 被 大 量 用 于 检 测癌 细 胞 中 原 癌 基 因 表 达 量 的 升 高 及 抑 癌 基 因 表 达 量 的 下 降 ， 器 官 移 植 过 程 中由 于 免 疫 排 斥 反 应 造 成 某 些 基 因 表 达 量 的 上 升 ， Northern blot 还 可 用 来 检 测目 的 基 因 是 否 具 有 可 变 剪 切 产 物 或 者 重 复 序 列 。
优 缺 点分 析 基 因 的 表 达 可 以 有 很 多 种 不 同 的 方 法 ， 除 northern blot 外 还 有 RT-PCR、 基 因 芯 片 、 RNA 酶 保 护 实 验 等 基 因 芯 片 常 和 northern blot 一 起 使 用 ，但 通 常 情 况 下 ， northernblot 的 灵 敏 度 要 好 于 基 因 芯 片 实 验 ， 而 基 因 芯 片 优势 在 于 它 可 在 一 次 实 验 中 同 时 反 映 出 几 千 个 基 因 表 达 量 的 变 化 与 定 量PCR 的 高 灵 敏 度 相 比 ， northern blot 显 然 要 逊 色 不 少 ， 但 northern blot 较 高的 特 异 性 可 以 有 效 的 减 少 实 验 结 果 的 假 阳 性 Northern blot 实 验 中 一 个 主 要的 问 题 是 存 在 RNA 的 降 解 ， 所 以 northern blot 中 所 有 的 实 验 用 品 都 需 要 经过 除 去 RNA 酶 的 过 程 ， 如 高 温 烘 烤 、 DEPC 处 理 等 。
同 时 ， norther blot 中很 多 实 验 用 品 如 甲 醛 、 EB、 DEPC、 紫 外 灯 等 等 对 人 体 都 有 一 定 的 伤 害 Northern blot 的 优 势 在 于 它 可 检 测 目 的 片 段 的 大 小 、 是 否 具 有 可 变 剪 切出 现 、 可 允 许 探 针 的 部 分 不 配 对 性 ， 杂 交 过 后 的 膜 经 过 一 定 的 处 理 除 去 探 针后 还 可 保 存 很 长 时 间 再 次 杂 交 使 用 Northern blot 技术经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的 RNA 电泳这一方法原于 McMaster 和 Carmichael(1977) 含有乙二醛－DMSO 的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳， 因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的 H＋梯度尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率(Miller，1987)，但用含朋乙二醛－DMSO 的凝胶对 RNA 进行分级离，通常 Northern 杂交所显示的 RNA 条带更为锐利1)在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：6mol/L 乙二醛 5.4μlDMSO 16.0μl0.1mol/L 磷酸(pH7.0) 3.0μlRNA(多达 10μl) 5.4μl 市售乙二醛通常为 40％溶液(6mol/L)。
由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂(Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液 pH 值大于 5.0 为止，然后可分装在小份， 用盖紧的小管贮存于－20℃每小份乙二醛溶液只用 1 次，剩余液体应予丢弃0.1mol/L 磷酸钠(pH7. 0)的配法如下：将 3.9ml 1mol/L 磷酸二氢钠、6.1ml 1mol/L 磷酸氢二钠和 90ml 水混合，用 DEPC 处理上述溶液后高压灭菌每一泳道至多可分析 10μg RNA，通常用 10- 20 μg 细胞总 RNA 进行 Northern 杂交，可以检测高丰度 mRNA(占 mRNA 总量的 0.1％以上)，如等测 RNA 含量极微，每个泳道应加 0.5-3.0μg poly(A)+RNA2)将微量离心管盖严，将 RNA 溶液置于％0℃温育 50℃温育 60 分钟后， 用冰水浴冷却样品，离心 5 秒钟，使管内所有液体沉降至管底3)于 50℃温育 RNA 溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用 1.4 ％琼脂糖分析 1kb 以下的 RNA样品， 而用 1％琼脂糖分析 1kb 以上的 RNA 样品。
用 0mmol/L 磷酸钠(pH7. 0 )后， 降温至 70 ℃， 加入碘乙酸钠固体至终浓度为 10mmol/L(使 RNA 酶失活)，再降温至 50℃，制胶，加入 RNA 样品前一至少放置 30 分钟使其凝固用于 RNA 电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满 3％H2O2，于室温放置 10 分钟后，用经 DEPC 处理的水彻底冲洗电泳槽因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭4)将 RNA 样品冷却至 0℃，加入 4μl 灭菌的并经用 DEPC 处理的戊二醛－DMSO 凝胶中样缓冲液，随后立即将上述样品加至凝胶加样孔用已知大小的乙醛酰 RNA 作为分子量标准参照物，如用 18S 和 28S rRNA 或或 9S 兔 β－珠蛋白 mRNA，上述 RNA 长度分别为 6322、2366 和 710 个碱基也可以从 BRL 购置已知大小的 RNA 混合物作为分子量标准照物通常分子量标准参照物的泳道位于凝胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色，可能的话应在分子量标准参照物以及欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留空一个泳道。
乙二醛－DMSO 凝胶加样缓冲液50％甘油10mmol/L 磷酸钠(pH7.0)0.25％溴酚蓝0.25％二甲苯青 FF5)将凝胶浸入 10mmol/L 磷酸钠电泳液中，以 3－4V/cm 电压降进行电泳，同时按图 7.1 对磷酸钠容液时行持续再循环，使溶液 pH 值维持在可被接受的限度 内(pH>8.0 时乙二。
