第三章细胞生物学研究方法复习题.doc

第三章复习题：基本概念：1.分辨率 resoving power ：指人眼或显微镜在 25cm 明视距离处，能分辨被 检物体细微结构最小距离的能力，其单位为长度单位，常用的有毫米、微米、纳米等2.冰冻蚀刻 freeze etching 电子显微镜技术：是为配合透射电镜观察而设计的一种标本制作技术其原理及过程是用快速低温冷冻法将样品迅速冷冻，然后在低温下进行断裂这时，样品往往从其结构相对脆弱的部位（膜脂双分子层的疏水端）断裂，从而显示出镶嵌在膜脂中蛋白质颗粒由于冰在真空中少量升华，可 进一步增强浮雕式的蚀刻效果用铂、金等金属 进行倾斜喷镀，以形成 对应于凹凸的电子反差，在经碳垂直于断面进行真空喷镀形成一个连续的碳膜，然后，用消化液把赝品本身消化掉，将剩下的碳膜及其构成图形的金属微粒移到载网上用电镜进行观察冰冻蚀刻技术主要用于观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构，图形富有立体感，样品不需包埋甚至也不需固定，同 时能更好地保持样品的真实结构它是研究生物膜内部结构的一种有用技术3.细胞化学法：是一类经典的细胞生物学实验方法，其特点是不依赖经验染色技术，而是基于已有的化学反应，在 细胞原位上显示出细胞的化学成分以及在不同条件下的形态、成分和功能的综合变化，将 结构和机能更紧密地联系在一起。

为了能在完好的结构上同时显示其化学物质，细胞化学技术必须满足下列要求：保持细胞在生活状态下的结构；保持细胞内的生前化学成分及酶活性；进行的方法是已知的化学反应；具有高度特异性；反应产物是一种有色物质，能形成稳定的沉淀，定位精确，或者电子密度高以供电子显微镜观察用4.Schiff 反应：细胞中的醛基可使 Schiff 试剂中的无色品红变为红色这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen 反应：可以特定显示 DNA 的分布，酸水解可以去除 RNA，并去除 DNA 上嘌呤脱氧核糖核酸上的嘌呤，使脱氧核糖核酸的醛基曝露，自由的醛基与Schiff 反应呈紫红色 ）5.显微放射自显影 microautoradiography ：是将放射性分子引入机体或细胞,使其渗入生物大分子,或结合于一定部位.在利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用显示样品中放射物质的所在.由此指示某种生物大分子质合成及部位,或特定物质的定位.放射自显影术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等，其原理是将放射性同位素（如 14C 和 3H）标记的化合物导入生物体内， 经过一段时间 后，将 标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。

然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知 标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样 便可在显微镜下对标记上放射性的化合物 进行定位或相对定量测定6.电子显微镜三维重构技术:是电子显微术\电子衍射与 计算机图像处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术.尤其适用于分析难以形成三维晶体的膜蛋白以及病毒和蛋白质核酸复合物等大的复合体的三维结构.其基本步骤是对生物样品在电镜中不同倾角下进行拍照,得到一系列电子显微镜图片后在经傅立叶变换等处理,从而展现出大分子及其复合物三维结构的电子密度图.7.密度梯度离心 density gradient centrifugation:是细胞组分通过某些梯度密度溶液离心使得各个成分互相分开的技术.操作时应将要分离细胞组分小心地铺在含有密度不断增加的、形成密度梯度的高溶解性的惰性物质（如蔗糖）溶液的表面在这种条件下进行离心，不同组分以不同的沉降速率沉降，形成不同的沉淀带，而使不同的组分得以分离8.差速离心 differential centrifugation:是利用不同速度离心所 产生的不同离心力将各亚细胞组分或各种颗粒分次沉淀的分离技术。

8.荧光原位杂交 fluorescent in situ hybridization,FISH：是在细胞保持基本形态的情况下将荧光探针注入细胞内与 DNA 或 RNA 杂交，通过观察荧光标记物的杂交位置来定位染色体或其他结构的标记技术根据所用探针种类和要检测核酸的不同可分为 DNA-DNA、 RNA – DNA、RNA-RNA 杂交无论哪一种杂交，其基本程序都是适当处理是细胞通透性增加，探针进入细胞内与 DNA 或 RNA 杂交、洗脱等步骤9.细胞株 cell strain 和细胞系 cell line:原代培养的细胞一般传至 10 代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，大部分 细胞衰老死亡，但有极少数细胞可渡过危机而存活下去这些存活的细胞一般可顺利地传 40~50 代次，并且仍然保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为很多学者把这种传代细胞称为细胞株一般情况下，当细胞株传至 50 代后又要出现危机，不能再传下去但如有部分细胞发生了遗传突变，产生癌细胞的特点，有可能在培养条件下无限制地传下去，这种传代细胞称为细胞系细胞系细胞的根本特点是染色体明显改变，一般呈现亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制的细胞容易传代培养。

10.原代细胞培养：是指直接从有机体中取得细胞或组织后立即进行的培养，严格的说是指成功继代之前的培养，此时细胞保持原有的基本性质，通常把第一代到第十代以内的培养细胞统称为元代细胞培养11.核酸的杂交：通过互补的 DNA 或 RNA 探针与研究的 DNA 或 RNA 之间进行碱基配对，分离或鉴定特异的核酸片断也可用于比较两个核酸之间的相似性12.显微操作技术（micromanipulation technique）是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器（micrcmanipulator）进行细 胞或早期胚胎操作的一种方法显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置13.分子杂交技术（molecular hybridization）是在研究 DNA 分子复性变化基础上发展起来的一种技术其原理是，具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成 DNA-DNA，DNA-RNA 或 RNA-RNA 杂交的双链分子 这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系14.细胞融合:真核细胞通过介 导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）.基因型相同的细胞融合成的杂 交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。

问答题：1.简述细胞生物学的主要研究方法？代表细胞生物学传统和发展方向的研究方法，可以分为四大方面 （1）显微技术，这是进行细胞形态结构观察的方法，包括光学显微术、电子显微术和扫描隧道显微术等，目前的分辨本领已达到 0.1nm 的水平，可以直接观察到 DNA、RNA 和蛋白质等生物大分子及生物膜、病毒等结构 （2）细胞组分的分析与原为检测技术，这类方法可对亚细胞结构和生物大分子进行分离和纯化，并可在细胞的原位上检测亚细胞结构和某些大分子的存在状况；（3）细胞培养和细胞工程技术，这是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究和生物工程中重要的实验技术，具有广泛的、重要的理论意义和实践价值；（4）分子生物学技术，如核酸和蛋白成分的分析和序列测定；核酸的杂交、PCR、基因的克隆与表达以及基因的剔除、RNA 干扰技术等，这些都是当今细胞生物学研究中常常使用的实验方法而且一些物理、化学和信息处理技术也正在被用于细胞生物学的研究现代细胞生物学的方法及其多样和处于不断的发展当中2.简述动物转基因技术的过程转基因动物技术是一项复杂而且涉及内容广泛的技术，其制作过程如下：（1）克隆目的基因；（2）给目的基因接上适当的启动子元件；（3）外源基因的导入，即利用显微操作或其他方法将外源基因注射到动物早期胚胎中，再把胚胎植入动物子宫内；（4）外源基因整合与表达的检测。

转入基因一般是随机整合到宿主动物基因组，但并非所有的外源基因都能整合到动物基因组，而整合的基因也并非都能表达因此需要对转基因动物进行严格的检测和筛选在转基因动物制作中，基因转移是影响外源基因整合效率的关键步骤，也是技术难度最大的步骤3.在进行细胞组分的分离时，实验方案设计的一般原则是什么？根据不同的细胞器或分子具有不同的体积与密度，通过离心力场的作用加以分离根据这两个主要因素可设计不同的离心方法：速度离心、等密度离心等4．匹配题：从下列 20 种方法中挑选一种最佳方法来探测下面的 10 个问题a. 电子显微镜三维成像与 X 射线衍射及核磁共振技 术； b. southern 杂交；c.扫描电镜技 术；d.细胞显微分光光度法；e.免疫荧光技 术；f.电子显 微镜超薄技术；g.Northern 杂交；h.放射自显影技 术； I.超离心技术；j.DNA 序列分析；k.原位杂交技 术；l.Western 杂交技术；m.单克隆抗体技术；n.电子显微镜 复染技术；o.细胞融合技术；p.流式细胞术 ；q.免疫电子显 微镜技术；r.冷冻蚀刻复型技 术；s.细胞培养技术；t.显微操作技术问题：1. 高等动物克隆的制作（T ）。

2. 某种抗癌药物的作用机制是阻止肿瘤细胞的 DNA 复制还是阻止蛋白质合成( H )3. 已克隆了鸡卵清蛋白的基因，如何证明在雏鸡的输卵管中该基因不转录而在产卵母鸡输卵管中活跃的转录（G ）4. 已克隆了人的 rDNA，问 rDNA 分布在人的那几条染色体上（K）5. 研究线粒体中 F0-F1-ATP 酶、泛素依赖性蛋白水解酶复合体的结构机作用机制（A）6. 体外细胞培养，从 G1 期到 S 期，细胞表面形态结 构的变化（C ）7. 研究表皮生长因子受体分布的部位及其合成、转运和降解的动态过程（Q ）8. 原代培养细胞长成致密蛋层，由于接触抑制作用 DNA 合成停止，如何证明（P ）9. 观察县病毒衣壳表面的亚单位-衣粒形态与排列方式（ N）10.研究酵母菌在无氧和有氧条件下生长时，其线粒体形态结构的变化（F ）。