红外分光光度法中国药品检验标准操作规范.doc

红外分光光度法１ 简述化合物受红外辐射照射后,使分子的振动和转动运动由较低能级向较高能级跃迁，从而导致对特定频率红外辐射的选择性吸收,形成特征性很强的红外吸收光谱,红外光谱又称振-转光谱红外光谱是鉴别物质和分析物质化学结构的有效手段，已被广泛应用于物质的定性鉴别、物相分析和定量测定,并用于研究分子间和分子内部的相互作用习惯上,往往把红外区分为３个区域，即近红外区(12８0０～４０00cｍ,0.78～2.5mm）其中中红外区是药物分析中最常用的区域红外吸收与物质浓度的关系在一定范围内服从于朗伯-比尔定律,因而它也是红外分光光度法定量的基础红外分光光度计分为色散型和傅里叶变换型两种前者主要由光源、单色器(通常为光栅）、样品室、检测器、记录仪、控制和数据处理系统组成以光栅为色散元件的红外分光光度计,以波数为线性刻度，以棱镜为色散元件的仪器，以波长为线性刻度波数与波长的换算关系如下：波数(ｃm-1）=傅里叶变换型红外光谱仪（简称FT－IR)则由光学台（包括光源、干涉仪、样品室和检测器）、记录装置和处理系统组成,由干涉图变为红外光谱需经快速傅里叶变换该型仪器现已成为最常用的仪器2 红外分光光度计的检定所用仪器应按现行国家质量与核查技术监督局“色散型红外分光光度计检定规程”、“傅里叶变换红外光谱仪检定规程”和《中国药典》附录规定，并参考仪器说明书，对仪器定期进行校正检定。

2．1 波数准确度2.1.1波数准确度的允差范围 傅里叶变换红外光谱仪在300０ｃm-1附近的波数误差应不大于±5cｍ-1,在１00０cm－1附近的波数误差应不大于±1ｃm-1２.1.2波数准确度检定方法2.1.2.1以聚苯乙烯膜校正 按仪器使用说明书要求设置参数，以常用的扫描速度记录厚度为5０mｍ的聚苯乙烯膜红外光谱图测量有关谱带的位置,其吸收光谱图应符合《药品红外光谱集》所附聚苯乙烯图谱的要求，并与参考波数(表1）比较,计算波数准确度表1 聚苯乙烯吸收谱带常用的波数值波数(ｃm－１) 　 　 　 　 　　　 波数（cm－1）302７.1 　 　 　 　　　　 　　 　 　 　 　1583.1２850.7 　 　 　　 　 　 　 　 115４．319４４.０ 　 　 　 　 　 10２８.0１801.6　 　 　　 　 　 　 　 　 906.７16０1.4２.1.2.2以液体池用液体茚校正 液体茚在39０0~690cm-１范围内有较多的吸收峰可资比较,适于测定中等分辨率的仪器。

一般需用适当液层厚度的固定厚度密封液体池，选用液体池的窗片材料应能保证在测量波数范围内有良好的红外光透过率，窗片应有良好的光洁度和平面平行度，注样品时将液体池放在一楔形板上，打开2个进样孔塞，把样品用专用注射器从下部进样孔缓缓注入同时观察池内液面缓缓上升而不夹带气泡，至液体在上进样孔内接近满溢时，取下注射器,先盖好下进样孔塞，再盖上上进样孔塞,吸去外溢液体后即可在仪器上测定吸收光谱，其主要谱带见表2表2　茚主要吸收谱带的波数值(5０mm液层,cm-1)3926．5 　 　　　　3１39.5 　 2771.0 　 　　191５．３ 　１553.2　 １３６1.１ 1２05．1　 　 　 １０18.5 　830.５ 　 　　 5９０.82．2　波数重现性 用与2.1波数准确度测量相同的仪器参数，对同一张聚苯乙烯膜进行反复重叠扫描一般扫描3～5次从扫描所得光谱测定波数的重现性测得的各吸收峰的重现性应符合现行国家技术监督局的要求2．３ 分辨率 以聚苯乙烯膜检定色散型红外仪用常规狭缝程序，通常的扫描速度，或以较窄的狭缝程序用较慢的扫描速度，记录聚苯乙烯的图谱。

傅里叶红外仪设置于2cm－1分辨率和适宜的扫描次数，依法记录光谱图在３1１0～285０cm－1范围内，应能显示７个吸收带，其中峰2８51ｃｍ-1与谷28７０cm-１之间的分辨深度应不小于1８％透光率；又峰1583cｍ－1与谷15８9ｃｍ-1之间的分辨深度应不小于１2%透光率仪器的标称分辨率，应不低于2 ｃm-１2.4 10０%线平直度　调节1０0％控制旋钮,使记录笔置于95%透光率处，以快速扫描速度扫描全波段,其100%线的偏差应小于１%透光率2.5 噪声 调节1０0%控制旋钮,使记录笔置于95％透光率处,在10０0cｍ－1处定波数连续扫描5min，其最大噪声（峰-峰值）应小于1%透光率2．6 其他 杂散光水平和透光率准确度检查，因需要特殊器件,且对药品测定影响不大，故不作硬性要求3 红外光谱测定操作方法红外光谱测定技术分两类一类是指检测方法,如透射、衰减全反射、漫反射、光声及红外发射等；另一类是指制样技术在药物分析中,通常测定的都是透射光谱，采用的制样技术主要有压片法、糊法、膜法、溶液法、衰减全反射法和气体吸收池法等3.1　压片法 取供试品约1~1.５ｍg，置玛瑙研钵中,加入干燥的溴化钾或氯化钾细粉约２00～300mｇ（与供试品的比约为200：1)作为分散剂，充分研磨混匀，置于直径为13mm的压片模具中,使铺展均匀，抽真空约2min，加压至（0.8×１06）kPa(约8～１0Ｔ／cm2）,保持压力2miｎ，撤去压力并放气后取出制成的供试片，目视检测,片子应呈透明状，其中样品分布应均匀,并无明显的颗粒状样品。

亦可采用其他直径的压模制片，样品与分散剂的用量需相应调整以制得浓度合适的片子３．2 糊法　取供试品约5mg，置玛瑙研钵中，粉碎研细后，滴加少量液状石蜡或其他适宜的糊剂,研成均匀的糊状物,取适量糊状物夹于两个窗片或空白溴化钾片（每片约150mｇ)之间,作为供试片，另以溴化钾约300mg制成空白作为补偿亦可用专用装置夹持糊状物制备时应注意尽量使糊状样品在窗片间分布均匀3.3　膜法 参照上述糊法所述的方法，将能形成薄膜的液体样品铺展于适宜的盐片中，使形成薄膜后测定若为高分子聚合物，可先制成适宜厚度的高分子薄膜,直接置于样品光路中测定熔点较低的固体样品可采用熔融成膜的方法制样3.4　溶液法　将供试品溶于适宜的溶剂中，制成1%~1０%浓度的溶液,灌入适宜厚度的液体池中测定常用溶剂有四氯化碳、三氯甲烷、二硫化碳、己烷、环己烷及二氯乙烷等选用溶液应在被测定区域中透明或仅有中至弱的吸收,且与样品间的相互作用应尽可能小3.5　气体吸收池法　测定气体样品需使用气体吸收池，常用气体吸收池的光路长度为1０cm通常先把气体吸收池抽空，然后充以适当压力(约50ｍmHg)的供试品测定也可用注射器向气体吸收池内注入适量的样品，待样品完全气化后测定。

３.６　衰减全反射法（AＴＲ） 取供试品适量，均匀地铺展在衰减全反射棱镜的底面上，使紧密接触，依法录制反射光谱图本法适用于纤维、高分子聚合物等难粉碎的样品3.7　试样的制备方法除另有规定外，用作鉴别时应按照药典委员会编订的《药品红外光谱集》第一卷（19９5年版)、第二卷（2０00年版)、第三卷(20０5年版)和第四卷（２０10年版)收载的各光谱图所规定的制备方法制备具体操作技术可参见《药品红外光谱集》的说明当新卷收载旧卷相同谱号的光谱图时，旧卷图谱作废用作晶型、异构体限度检查或含量测定时,试样制备和具体测定方法均按药典各品种项下有关规定操作4 供试品的测定４.1 原料药的鉴别 采用固体制样技术时，最常碰到的问题是多晶型现象,固体样品的晶型不同,其红外光谱往往也会产生差异当供试品的实测光谱与《药品红外光谱集》所收载的对照图不一致时，在排除各种可能影响光谱的外在或人为因素后,应按该药品光谱图中备注的方法或各品种项下规定的方法进行预处理，再绘制光谱，进行比对如未规定该品种供药用的晶型或预处理方法，则可使用对照品,并采用适当的溶剂对供试品与对照品在相同的条件下同时进行重结晶,然后依法绘制光谱,进行比对。

如已规定特定的药用晶型,则应采用相应晶型的对照品依法进行比对当采用固体制样技术不能满足鉴别需要时，可改用溶液法绘制光谱后对比4.2　制剂的鉴别4.2．１ 分类4.2.１.1不加辅料的制剂　如无菌原料直接分装的注射用粉针剂及不加辅料的冻干剂和胶囊剂等其他成品，可直接取内容物绘制光谱图进行鉴别４.２.１.２单方制剂　一般采取简单的提取分离手段就能有效去除辅料,可根据不同剂型的特点选择不同的分离提取方法，取干燥后的提取物绘制光谱图进行鉴别4.２.1.3复方制剂 一般情况比较复杂，根据具体问题具体分析4.2.2 前处理4．2.2.１ 预处理 对可能影响样品红外光谱的部分，在提取前应尽量去除,如对于包衣制剂应先去除包衣，双层片将二层分开等4.2.2.２ 提取 一般按各品种项下规定的方法对待测成分进行分离提取如品种项下未规定提取方法，对国外药典已收载有红外光谱鉴别的制剂或有其他相关文献资料的品种,可参考相关文献方法进行处理对于无文献资料的药物制剂,可根据活性成分和辅料的性质选择适当的提取方法首选易挥发、非极性的有机溶剂为提取溶剂,如乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚、乙醇、甲醇等；如标准光谱集中有转晶方法，或可获得原料药的精制溶剂，最好选用与转晶方法相同的溶剂或精制溶剂。

若首选溶剂不适用，可考虑混合溶剂一般所选溶剂为无水溶剂，提取时有机层可加无水硫酸钠除去水分根据活性成分和辅料的溶解度不同,通过选择适合的溶剂即能提取活性成分又能去除辅料，则采用直接提取法对于多数药品,一般选用的常用溶剂如水、甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醚、石油醚等就能基本达到分离效果,非极性溶剂的效果比极性的好一般非电离有机物质(不是有机酸或有机碱的盐）采用此法可获得满意的结果如冻干制剂常用辅料均不溶于乙醇和甲醇,用醇提取均能获得满意结果；辅料只有水的液体制剂，可蒸干水分后绘制红外光谱对于液体或半固体制剂宜选择萃取法,可根据活性成分和辅料性质选用直接萃取法，当有机酸或有机碱的盐类药物经直接提取法不能够获得满意的光谱图时，一般采用经酸化（或碱化)后再萃取的方法，但需与活性物质(基)的红外光谱进行比对含有待测成分的提取溶液经过滤后,可选择析晶、蒸干、挥发等方法获得待测成分;必要时可经洗涤、重结晶等方法纯化４.2．3　干燥 可根据《药品红外光谱集》备注中的干燥方法对待测成分进行干燥,也可采用各种项下规定的干燥失重方法或参考(《中国药典》2010年版二部附录Ⅷ　L)干燥失重测定法项下的方法进行干燥，可视待测成分情况适当增减干燥时间。

4.2．4　图谱对比４.２.4．1辅料无干扰，待测成分的晶型不变化,此时可直接与对照品图谱或对照图谱进行比对４.2．4．2 辅料无干扰,但待测成分的晶型有变化,此种情况可用对照品经同法处理后的图谱比对4.２.４．3 待测成分的晶型不变化,而辅料存在不同程度的干扰,此时可参照原料药的对照图谱,在指纹区内选择3~5个不受辅料干扰的待测成分的特征谱带作为鉴别的依据鉴别时，实测谱带的波数误差应小于规定值的０.5%4．2．4．4 待测成分的晶型有变化,辅料也存在干扰,此种情况一般不宜采用红外光谱鉴别4.3　多组分原料药的鉴别　不能采用全光谱对比,可借鉴4.２.4.3的方法,选择主要成分的若干个特征谱带,用于组成相对稳定的多组分原料药的鉴别4.４　晶型、异构体的限度检查或含量测定 供试品制备和具体测定方法均按各品种项下有关规定操作5 测量操作注意事项５．1 环境条件 红外实验室的室温应控制在１５～30℃，相对湿度应小于65。