血吸虫病预防控制工作规范 部分(章节).doc

.. ..血吸虫病预防控制工作规范 部分(章节)三、血吸虫病查病技术规范1 查病对象和频次1.1 一类流行村每年对6～65岁常住居民采用询检法查病1～2次，受检率达90％以上1.2 二类流行村每年传播季节结束后1个月，对有疫水接触史的6～65岁常住居民采用血清学方法查病1次，受检率达90％以上1.3 三类流行村每2年在传播季节结束后，对有疫水接触史的6～65岁常住居民采用血清学方法查病1次，受检率达90％以上1.4 四类流行村每3年对有钉螺分布的村民组和有疫水接触史的6～65岁常住居民，采用血清学方法查病1次，受检率均达90％以上对当年检获感染性钉螺的村，采用血清学方法对相关村民组6～65岁常住居民查病1次，受检率达90％以上1.5 五类流行村对当年检获钉螺的村，采用血清学方法对相关村民组6～65岁常住居民查病1次，受检率均达90％以上1.6对有疫水接触史的流动人群，每年采用询检法或血清学方法查病1次2 查病方法2.1 询检法主要是询问受检人员在末次治疗后，近1～2年有无疫水接触史及有无发热、腹泻等主要血吸虫病症状2.1.1 材料准备听诊器、血压计、询检法调查登记表。

2.1.2 操作步骤2.1.2.1 应仔细询问受检者血吸虫病查治史、末次治疗时间及此后接触疫水地点、时间、接触方式及出现的症状2.1.2.2 必要的体格检查排除其他非血吸虫病引起的发热、腹泻、肝肿大等临床症状体征2.1.3 诊断标准末次治疗后，近1～2年内有疫水接触史或疑似血吸虫病症状，定为本法阳性2.1.4 注意事项2.1.4.1 应注意受检者接触水体地点周围的钉螺分布变迁及现状2.1.4.2 避免诱导性询问血吸虫病出现的临床症状和体征2.2 血清学方法根据抗原和特异性抗体结合原理，用已知抗原（抗体）和采集的人体血清进行体外检测抗体（抗原）的方法目前人群查病常用的血清学方法有如下几种，可选任何一种方法进行病情调查，由于血清学方法存在诸多不确定因素，一般不用于效果评价2.2.1 环卵沉淀试验(COPT)2.2.1.1 材料准备抗原（热处理超声干燥虫卵粉）、石蜡、载（盖）玻片、显微镜、温箱、离心机、滴管、塑料管、针头等2.2.1.2 操作步骤采集获取受检者血清，用熔化的石蜡在洁净的载玻片两端分别划两条相距20mm的蜡线，在蜡线之间加受检者血清2滴(0.05～0.10ml)，然后用针头挑取干卵约100～150个，加入血清中，混匀，覆以24mm24mm盖玻片，四周用液化石蜡密封后，置于37℃温箱中，经48～72h后用低倍(80～100)显微镜观察反应结果，疑似者应在高倍(400)显微镜下加以鉴别。

2.2.1.3 结果判断2.2.1.3.1 阳性反应虫卵周围产生边缘较整齐、光滑，并有明显折光的泡状、指状或细长卷曲的带状沉淀物其中泡状沉淀物须大于10μm(约相当于两个红细胞大小)，才能定为阳性，记录发生阳性反应的虫卵数，按下式计算环沉率环沉率(%)=(阳性虫卵数/全片观察正常虫卵数)100 2.2.1.3.2 阴性反应虫卵周围光滑，无沉淀物或有小于10μm的泡状沉淀物2.2.1.4 诊断标准环沉率≥3%定为本方法检查阳性2.2.1.5 注意事项2.2.1.5.1 干卵应以重感染兔血清(感染1500～2000条尾蚴的兔血清)测试，环沉率＞30%者为合格抗原2.2.1.5.2 划蜡线应将石蜡加热至开始冒烟时，用棉签蘸蜡一次划成，以保证蜡线厚薄均匀，蜡线不宜过厚，线间距离不宜小于20mm2.2.1.5.3 在试验血清中挑入干卵数不宜过多，以100～150个为宜，并使虫卵均匀分散，切勿成团块2.2.1.5.4 宜用2424mm(或2222mm)的盖玻片覆盖，一次蜡封，以避免密封不严，影响反应结果2.2.1.5.5 检测Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ类流行村人群时，虫卵孵育时间可酌情延长到72h，以便提高阳性检出率。

2.2.1.5.6 要善于识别粘附于干卵周围的红细胞、组织碎片及从卵壳破裂处渗出的毛蚴组织等，通常在高倍镜观察时，易于识别这些物质2.2.1.5.7 已检查完毕的标本片，可用3％甲酚皂(来苏尔)溶液浸泡1～2天，待盖玻片脱开后，分别清洗，拭干备用2.2.1.5.8 不成熟虫卵、破卵不计算在被观察的虫卵总数内2.2.1.5.9 国内有关COPT的操作方法较多，除上述常用方法外，还有塑料管法、双面胶纸条法、PVC薄膜抗原片法、PVF抗原片法，血凝板法，以及IEST法等都可选用，阳性标准与常用玻片法相同2.2.2 间接血球凝集试验(IHA)2.2.2.1 材料准备可溶性血吸虫卵抗原致敏的冻干“O”型红细胞或绵羊红细胞、V形微量反应板、塑料管、采血针、酒精棉球、微量滴管、生理盐水、离心机等2.2.2.2 操作步骤2.2.2.2.1 采集获取受检对象血清2.2.2.2.2 配置致敏红细胞悬液：取冻干致敏红细胞1支，每支加用致敏红细胞稀释液1ml，充分混匀2.2.2.2.3 血凝板的第1列第1孔加标本稀释液100μl（4滴），第2～4孔加标本稀释液25μl（1滴）于第1孔加25μl（1滴）待测血清，充分混匀后吸出25μl于第2孔，第2孔充分混匀后依次倍比稀释至第4孔，在第4孔混匀后弃去多余的25μl （1滴），然后将第1孔吸取75μl弃去，第1～4孔血清稀释度分别为1:5、1:10、1:20和1:40。

2.2.2.2.4 于稀释后的每孔血清加致敏红细胞悬液25μl（1滴），震摇1～2min，置37℃,30min后观察结果2.2.2.2.5 每次试验均应设阴性、阳性对照阳性、阴性对照血清为冻干品，使用前每管加100μl蒸馏水稀释，充分溶解后使用2.2.2.3 结果判断2.2.2.3.1 阴性反应红细胞全部沉入孔底，肉眼见一边缘光滑，致密的小圆点2.2.2.3.2 阳性反应：红细胞成明显颗粒凝集散布于孔底，周围不形成致密的圆点，强阳性时凝集物边缘形成不规则的皱褶2.2.2.4 诊断标准以血清1:10稀释出现阳性反应可判为本法阳性2.2.2.5 注意事项2.2.2.5.1 受检者血清以1:10稀释，出现阳性反应作为阳性反应的起点较为适宜2.2.2.5.2 冻干致敏红细胞于4℃可较长时期保存，其效价不变室温中保存则不宜超过3个月2.2.2.5.3 待测血清标本以新鲜血清为宜2.2.2.5.4 实验时宜选用V形血凝反应板，形成终点快判断结果准2.2.2.5.5 因批号不同抗原效价有很大差异，应在查病前做效价测定，合格后方可使用2.2.2.5.6 用过的微量血凝反应板不能浸泡于酸、碱溶液中，也不能用毛刷洗擦，必须用高压自来水将沉积孔底的红细胞冲洗干净，再以蒸馏水洗2～3次，晾干使用。

急用时可将洗净的反应板置37℃温箱烘干2.2.2.5.7 必要时使用一次性反应板2.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)2.2.3.1 材料准备可溶性血吸虫卵抗原、聚苯乙烯塑料微量板、定量吸管、缓冲液和有关化学试剂、冰箱、恒温箱、ELISA检测仪等2.2.3.2 操作步骤2.2.3.2.1 采集获取受检对象血清2.2.3.2.2 于聚苯乙烯塑料微量板的凹孔中加入0.2ml以pH9.6碳酸盐缓冲液作1∶3000(或1∶1000，随抗原效价而定)稀释的虫卵抗原，置4℃过夜2.2.3.2.3 次日倾去抗原，用含有0.05％吐温—20的磷酸缓冲盐水(PBS/TpH7.4，0.01mol/L)洗涤3次，每次5min2.2.3.2.4 于凹孔中加入以PBS/T作1∶200稀释的受检者血清0.2ml，37℃ 2h2.2.3.2.5 倾去血清，以PBS/T洗涤3次，每次5min2.2.3.2.6 加入以PBS/T作1∶1000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)—标记结合物0.2ml，37℃，2h2.2.3.2.7 倾去酶标记结合物，以PBS/T洗涤3次，每次5min2.2.3.2.8 加入0.2ml邻苯二胺(OPD)底物溶液〔10mg OPD＋pH5.0柠檬酸缓冲液25ml＋30％过氧化氢10μl〕0.2ml，37℃，30min。

2.2.3.2.9 在各凹孔中加入2mol/L硫酸0.05ml以终止反应在酶标专用比色计上读取492nm光密度(OD)值2.2.3.2.10 每次实验均设阳性参考血清对照，同法求出其OD值以此对样本血清OD值进行校正2.2.3.3 诊断标准2.2.3.3.1 Dynatech酶标专用比色计：测定结果OD值≥0.5为血吸虫阳性2.2.3.3.2 目测受试血清凹孔中所显示的颜色浅于阴性对照血清颜色一个滴度者为血吸虫阳性2.2.3.4 注意事项2.2.3.4.1 试验时，每块反应板均应设标准参考阳性血清及阴性血清对照2.2.3.4.2 试验时，加底物前，反应板经洗涤、甩干后，不宜在空气中暴露过久，应速加底物，以免影响酶的活力而影响结果2.2.3.4.3 酶结合物浓度很重要，必须准确配制2.2.3.4.4 每次洗涤一定要干净，否则影响结果2.2.3.4.5 配制试剂的器皿最好能固定使用，不要经常更换2.2.3.4.6 目前国内有关改进ELISA的方法较多，除上述常用方法外，还有PVC薄膜快速ELISA法等选用2.2.4 胶体染料试纸条法（DDIA）2.2.4.1 材料准备试纸条、染料标记抗原1，PVC小杯（有试剂盒供应）。

2.2.4.2 操作步骤2.2.4.2.1 采集获取受检对象血清2.2.4.2.2 待检血清l0μl置检测PVC小杯中，另加入50μl标记染料的抗原液，轻轻混匀约1min2.2.4.2.3 取试纸条插入小杯中，约5～l0min2.2.4.2.4 待小杯内反应液吸干后（10 min左右）观察结果2.2.4.3 结果判断2.2.4.3.1 阳性反应检测带和对照带均显紫蓝色的沉淀带2.2.4.3.2 阴性反应对照带显示紫蓝色沉淀带而检测带无紫蓝色2.2.4.4 诊断标准出现阳性反应者可定为本法血吸虫阳性2.2.4.5 注意事项2.2.4.5.1 检测血清必须新鲜，否则会影响检测结果2.2.4.5.2 取试纸条时，用手捏住吸水垫（较长的一端），严禁触摸检测膜2.2.4.5.3 试纸条一定要插入杯底2.2.4.5.4 检测带反应过强时，对照带显色会减弱，甚至不显色，此结果仍判断为阳性反应2.2.4.5.5 该试纸条法与肺、肝吸虫病人血清有部分交叉反应，检测时应加注意2.2.4.5.6 试剂盒在4℃可保存6个月2.3 病原学方法目前在人群查病时运用的病原学方法是粪便检查法，在实际工作中可选用以下任何一种粪检方法。

2.3.1 尼龙袋集卵孵化法2.3.1.1 器材准备40～60目/英寸铜丝筛、260目/英寸尼龙绢袋、250ml三角烧杯、搪瓷杯、竹筷、尼龙绢袋支架、淋水用橡皮管、水桶、明矾、漂白粉等2.3.1.2 操作步骤2.3.1.2.1 取受检者粪便约30g，先置于40～60目/英寸的铜丝筛中，铜丝筛置于下口夹有铁夹的尼龙绢(260目/英寸)袋口上，淋水调浆，使粪液直接滤入尼龙绢袋中，然后移去铜丝筛，继续淋水冲洗袋内粪渣，并用竹筷在袋外轻轻刮动助滤，直到滤出液变清取下夹于袋底下口的铁夹，将袋内沉渣淋洗入三角烧瓶（若需加做沉渣镜检，可在烧。