酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定.ppt

酵母酵母RNARNA的提取、组分鉴定和含量测定的提取、组分鉴定和含量测定【【实验目的实验目的】】【【实验原理实验原理】】1.学习稀碱法提取学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法的原理和操作方法2.了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法3.掌握地衣酚显色法及紫外分光光度法测定掌握地衣酚显色法及紫外分光光度法测定酵母酵母RNA含量的原理和方法含量的原理和方法 酵母核酸中酵母核酸中RNARNA含量较多含量较多RNARNA可溶于碱性溶液，可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到糖核酸沉淀，由此即得到RNARNA的粗制品的粗制品 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可组分加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在以测出上述组分的存在 RNA RNA含量测定含量测定, ,除可用紫外吸收法、定磷法外除可用紫外吸收法、定磷法外, ,常用地衣酚法测定其反应原理是：当常用地衣酚法测定其反应原理是：当RNARNA与与浓盐酸共热时浓盐酸共热时, ,即发生降解即发生降解, ,形成的核糖继而转形成的核糖继而转变为变为糠醛糠醛, ,后者与后者与3,5-3,5-二羟基甲苯二羟基甲苯( (地衣酚地衣酚orcinol)orcinol)反应反应, ,在在FeFe3+3+或或CuCu2+2+催化下催化下, ,生成鲜绿色生成鲜绿色复合物。

复合物 反应产物在反应产物在670nm670nm处有最大吸收处有最大吸收,RNA,RNA浓度浓度在在10-100μg/ml10-100μg/ml范围内范围内, ,光吸收与光吸收与RNARNA浓度成正浓度成正比地衣酚法特异性差比地衣酚法特异性差, ,凡戊糖均有此反应凡戊糖均有此反应,DNA,DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色因此, ,测定测定RNARNA时可先测得时可先测得DNADNA含量再计算含量再计算RNARNA含量1.1.实验材料：实验材料： 酵母粉酵母粉 ( (或酵母片或酵母片) )【实验材料和主要仪器、试剂】【实验材料和主要仪器、试剂】2.2.实验仪器：实验仪器： 研钵、研钵、150mL150mL锥形瓶、恒温水浴锅、布氏漏斗锥形瓶、恒温水浴锅、布氏漏斗及抽滤瓶、离心机、漏斗、分光光度计及抽滤瓶、离心机、漏斗、分光光度计3.3.实验试剂：实验试剂：溶液、溶液、95%95%乙醇、酸性乙醇乙醇、酸性乙醇溶液、硫酸溶液溶液、硫酸溶液 、浓氨水、、浓氨水、硝酸银溶液硝酸银溶液 、氯化铁浓盐酸溶、氯化铁浓盐酸溶液、苔黑酚乙醇溶液、液、苔黑酚乙醇溶液、钼酸铵试剂（钼酸铵试剂（将将2g钼酸铵溶解在钼酸铵溶解在100ml10%硫酸中硫酸中））、标准、标准RNARNA母液、标准母液、标准RNARNA溶液、样品溶液、地衣溶液、样品溶液、地衣酚酚- -铜离子试剂铜离子试剂【实验材料和主要仪器、试剂】【实验材料和主要仪器、试剂】【操作步骤】【操作步骤】 的提取：的提取：将将5g5g酵母悬浮氢氧化钠溶液中，并酵母悬浮氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。

将悬浮液转移至在乳钵中研磨均匀将悬浮液转移至100100毫升毫升锥形瓶中在沸水浴上加热锥形瓶中在沸水浴上加热3030分钟后，冷却分钟后，冷却离心离心(3000r/min)15(3000r/min)15分钟，将上清液缓缓倾入分钟，将上清液缓缓倾入15 mL15 mL酸性乙醇溶液中注意要一边搅拌一边酸性乙醇溶液中注意要一边搅拌一边缓缓倾入待核糖核酸沉淀完全后，离心缓缓倾入待核糖核酸沉淀完全后，离心(3000r/min)3(3000r/min)3分钟弃去清液弃去清液用9595％乙醇洗％乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤沉淀可在空气将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤沉淀可在空气中干燥 的水解：的水解：取取200mg200mg提取的核酸，加入硫酸溶液提取的核酸，加入硫酸溶液10mL10mL，在沸水浴中加热，在沸水浴中加热1010分钟制成水解液并分钟制成水解液并进行组分的鉴定进行组分的鉴定的组分鉴定的组分鉴定（（1 1）嘌呤碱）嘌呤碱   取水解液取水解液1mL1mL加入过量浓氨加入过量浓氨水，然后加入约水，然后加入约1 mL1 mL硝酸银溶液，观察有硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物絮状沉淀生成。

无嘌呤碱的银化合物絮状沉淀生成的组分鉴定的组分鉴定（（2 2）核糖）核糖   取取1 1支试管加人水解液支试管加人水解液1mL1mL、三氯化铁、三氯化铁浓盐酸溶液浓盐酸溶液2mL2mL和苔黑酚乙醇溶液放沸水浴中和苔黑酚乙醇溶液放沸水浴中1010分钟注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在3 3）磷酸）磷酸    取取1 1支试管，加入支试管，加入1ml水解液，加入水解液，加入5滴浓滴浓HNO3和和1ml钼酸铵试剂后，在沸水浴中加热，钼酸铵试剂后，在沸水浴中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生，说明磷酸是否说明磷酸是否存在地衣酚法显色测定地衣酚法显色测定（（1)1)标准曲线的制作标准曲线的制作（（1)1)标准曲线的制作标准曲线的制作按上表编号及加入试剂加毕，摇匀，置沸水按上表编号及加入试剂加毕，摇匀，置沸水浴加热浴加热25min25min，取出后冷水冷却，以零号管作对，取出后冷水冷却，以零号管作对照照, ,于于670nm670nm波长处测定各管光吸收值取测定波长处测定各管光吸收值取测定的平均值的平均值, ,以以RNARNA浓度为横坐标浓度为横坐标, ,光吸收为纵坐标光吸收为纵坐标作图作图, ,绘制标准曲线。

绘制标准曲线(2)(2)样品的测定样品的测定取两支试管取两支试管, ,各加入样品注液各加入样品注液, ,再加地衣酚再加地衣酚- -Cu2+Cu2+试剂，如前述进行测定试剂，如前述进行测定. .(3)RNA(3)RNA含量的计算含量的计算根据测得的光吸收值根据测得的光吸收值, ,从标准曲线上查出相从标准曲线上查出相当该光吸收的当该光吸收的RNARNA含量，计算出制品中含量，计算出制品中RNARNA的百分含量的百分含量【注意事项】【注意事项】u样品中蛋白质含量较高时样品中蛋白质含量较高时, ,应先用应先用5%5%三氯乙酸溶三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定液沉淀蛋白质后再测定u本法特异性较差本法特异性较差, ,凡属戊糖均有反应凡属戊糖均有反应. .微量微量DNADNA无无影响影响, ,较多较多DNADNA存在时存在时, ,亦有干扰作用如在试剂亦有干扰作用如在试剂中加入适量中加入适量CuClCuCl2 2 .2H .2H2 2O O可减少可减少DNADNA的干扰此的干扰此外外, ,利用利用RNARNA和和DNADNA显色复合物的最大光吸收不同显色复合物的最大光吸收不同, ,且在不同时间显示最大色度加以区分。

反应且在不同时间显示最大色度加以区分反应2min2min后后,DNA,DNA在在600nm600nm呈现最大光吸收呈现最大光吸收, ,而而RNARNA则在则在反应反应15min15min后后, ,在在670nm670nm下呈现最大光吸收下呈现最大光吸收u定磷试剂含有还原剂抗坏血酸，抗坏血酸很容定磷试剂含有还原剂抗坏血酸，抗坏血酸很容易被空气中的氧所氧化，使定磷试剂失效因易被空气中的氧所氧化，使定磷试剂失效因此可以改用钼酸铵试剂定磷核酸分子中的有此可以改用钼酸铵试剂定磷核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下, ,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀【思考题】【思考题】1 1、如何得到高产量、如何得到高产量RNARNA粗制品？粗制品？2 2、验证、验证RNARNA中核糖的办法，可否用以检验脱中核糖的办法，可否用以检验脱氧核糖，为什么？氧核糖，为什么？3 3、用你所学过的化学知识、用你所学过的化学知识, ,分析分析3 3种催化剂：种催化剂：FeC1FeC13 3·6H·6H2 2O,CuC1O,CuC12 2·H·H2 2O O和和CuO,CuO,哪种催化剂的哪种催化剂的催化效果更好？催化效果更好？4 4、地衣酚反应中、地衣酚反应中, ,干扰干扰RNARNA测定的因素有哪些测定的因素有哪些 如何能减少它们的影响。

如何能减少它们的影响。