粪便标本中病原菌的分离与鉴定—麦楚填.doc

粪便标本中病原菌的分离培养和鉴定中山大学新华学院12级药学A班 马泽鑫12071081中ill大学新华学院12级纱学A班 麦楚填12071082一、【引言】粪便标本中常含有很多杂菌，为了检岀病原菌，选用伊红美蓝选 择鉴别培养基进行培养通过革兰氏染色并在油镜下观察细菌形态结 构、细菌的生化反应和细菌的血清学反应等手段可以区别和鉴定细菌的种类，最终确定致病菌二、【材料和方法】实验概况:1 •细菌的分离培养1.1材料:粪便标木、伊红美蓝培养基、接种环、酒精灯1.2方法:接种前，接种环烧灼灭菌用接种环挑取少许粪便标本涂于培养 基烧灼接种环上多余的标本冷却后，采用分区划线分离法，将粪 便标木接种于伊红美蓝培养基接种完毕后，接种环烧灼灭菌将平 板倒置37C培养24h,观察结果2. 细菌的纯培养2.1材料：粪便标本、斜而培养基、液体培养基、接种环、酒精灯2.2方法：1.接种前，接种环烧灼灭菌用接种环分别挑取少许紫黑色和粉红色细菌两种菌，并涂于不同斜面培养基最上方烧灼接种环上多 余的标本冷却后，采用Z字型划线分离法自上而下连续划线，将细 菌接种于斜面培养基接种完毕后，接种环烧灼灭菌将平板倒置 37° C培养24h,观察结果。

2.接种前，接种环烧灼灭菌用接种环分別挑取少许紫黑色和 粉红色细菌两种菌，分别接种于不同液体培养基接种完毕后，接种 环烧灼灭菌将平板倒置37C培养24h,观察结果3 •细菌个体形态特征的观察3.1革兰氏染色法3.1.1材料：粪便标本、生理盐水、稀甘油、结晶紫染液、碘液、酒精、沙黄染液、载玻片、酒精灯、接种环、显微镜3.1.2方法：接种前，接种环烧灼灭菌取两片载玻片，分别用接种环取1〜2 环生理盐水涂于载玻片中间烧灼接种环，冷却后用接种环分别挑取 少许紫黑色和粉红色细菌两种菌,涂于载玻片中,涂抹均匀后将载玻 片加热干燥固定，接种环烧灼灭菌在固定好的细菌涂片上滴加1-2 滴结晶紫染液，经1 min后用水缓缓冲洗；倾去玻片余水后，滴1〜2 碘液，经lmin后用水缓缓冲洗；倾去余水后，滴1〜2滴95%乙醇脱 色，经20s后用水缓缓冲洗；倾去余水后，滴加1〜2滴沙黄染液，经 lmin后用水缓缓冲洗，待标本晾干后，滴加稀甘油，油镜下观察3.2动力学试鸟 3.2.1材料:粪便标木、半固体培养基、接种针、酒精灯3.2.2方法：接种前，接种针烧灼灭菌用接种针分别沾取少许紫黑色和粉红色细菌两种菌，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部的4/5处，再循原来的路线推出接种针。

烧灼接种针，37°C培养24h,观察结果4 •细菌生化反应鉴别——糖发酵实验4-1材料：粪便标本、葡萄糖发酵微量管、乳糖发酵微量管、接种针、小砂 轮、酒精灯4.2方法：接种前，接种针烧灼灭菌冷却后用接种针分别沾取少许紫黑色和粉红色细菌两种菌，接种于葡萄糖发酵微量管以及乳糖发酵微量管，烧灼接种针上多余的标本37° C培养24h,观察结果5 •细菌血清学反应鉴定玻片凝集试验5.1材料:粪便标本、痢疾诊断血清、接种环、载玻片、酒精灯5.2方法：接种前，接种环烧灼灭菌取两片载玻片，分别用接种环取2环生理盐水涂于载玻片左侧烧灼接种环，用接种环取2环痢疾诊断血 清于载玻片右侧烧灼接种环，用接种环分别沾取少许紫黑色和粉红 色细菌两种菌，各自涂于生理盐水和痢疾诊断血清中涂抹均匀后慢 慢摇动玻片，观察现象三、【实验结果】1 •细胞的分离培养粪便中的细菌在伊红美蓝平板上形成A与B两种菌落颜色人小 直径表面A菌落 紫黑色 较大 2~3mni 光滑，不透明B菌落 粉红色 较小 1〜2mni 光滑，半透明2 •细菌的纯培养2・1斜面培养基培养紫黑色和粉红色细菌在斜面培养基上的生长状况:附：左为紫黑色细菌，右为粉红色细菌(1) 紫黑色细菌：白色不透明菌落(2) 粉红色细菌：透明菌落2.2液体培养基培养紫黑色和粉红色细菌在液体培养基上的生长状况无论是紫黑色细菌还是粉红色细菌，液体培养基均变浑浊。

3. 细菌个体形态特征的观察 3.1革兰氏染色法紫黑色和粉红色细菌在显微镜下观察（1） 紫黑色细菌：长杆状，粉红色，较粉红细菌细长革兰阴性菌（2） 粉红色细菌：短杆状，粉红色，较紫黑细菌粗人革兰阴性菌3.2动力学试验紫黑色和粉红色细菌在半固体培养基上的生长状况附：左为粉红色细菌，右为紫黑色细菌(1)紫黑色细菌：沿穿刺线扩散生长，穿刺线周围出现混浊，说明紫黑色细菌有鞭毛2)粉红色细菌：沿着穿刺线生长，没有扩散，说明粉红色细菌无鞭毛4 •细菌生化反应鉴别 糖发酵试验紫黑色和粉红色细菌糖发酵试验结果葡萄糖乳糖紫黑色细菌变成黄色产酸有气泡变成黄色产酸有气泡粉红色细菌变成黄色产酸依旧紫色不产酸无气泡5 •细菌血清学反应鉴定玻片凝集试验紫黑色和粉红色细菌玻片凝集试验结果生理盐水痢疾诊断血淸紫黑色细菌 均匀混浊均匀混浊粉红色细菌 均匀浑浊出现乳口色凝集块□□四、【实验讨论】 粪便标本在伊红-美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落1•在显微镜下观察时，可以发现紫黑色细菌是革兰阴性杆菌从糖酵解试验的结果分析来看，紫黑色细菌能使葡萄糖和乳糖的试管变色和 产气在动力学试验中，我们分析到紫黑色细菌有鞭毛在痢疾血清 玻片凝集试验中，看不到大小不等的乳白色凝块，说明紫黑色细菌不 是引起痢疾的致病菌。

又因为大肠埃希菌能分解乳糖产酸，使伊红与 美蓝呈色，形成紫黑色菌落，具有金属光泽大肠埃希菌为革兰阴性 杆菌，有鞭毛在牛化反应活泼，能分解葡萄糖、乳糖等多种糖类, 产酸并产气故综上所述，我们可以判断紫黑色细菌为大肠埃希菌 2.粉红色细菌在显微镜下观察时，可以发现粉红色细菌是革兰染色阴 性，短小杆菌从糖酵解试验的结果分析来看，粉红色细菌能分解葡 萄糖产酸不产气，不能分解乳糖在动力学试验中，我们分析到粉红 色细菌无鞭毛在痢疾血清玻片凝集试验中，可以看到大小不等的乳 白色凝块，说明粉红色细菌是引起痢疾的致病菌又因为痢疾杆菌为 革兰染色阴性，短小杆菌，无鞭毛痢疾杆菌是人类细菌性痢疾最为 常见的病原菌故综上所述，该粉红色细菌是痢疾杆菌五、【参考文献】《医学微生物学实验指导》作者：刘琼。