5个现代月季品种愈伤组织再生体系的建立与体细胞培养的.pdf

D i s s e r t a t i o nf o rM a s t e rD e g r e ei nA g r i c u l t u r eST U D YO NC A L L U SR E G E N E R A T I O NA N DC E L LSC U L T U R EO F5M O D E R NC a n d i d a t e ：R O S E SC U L T I V - A R SP a nB i n g b i n gS u p e r v i s o r ：P r o f ．C h eD a i d iA c a d e m i cD e g r e eA p p l i e df o r ：M a s t e ro f A g r i c u l t u r eS p e c i a l i t y ：O r n a m e n t a lH o r t i c u l t u r ea n dL a n d s c 印eA r c h i t e c t u r eD a t eo f0 r a lE x a m i n a t i o n ：J u n e ．2 01lU n i v e r s i t y ：N o r t h e a s tA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y一．目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．I英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I I Il 弓I 言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11 ．1 研究的目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11 ．2 研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21 ．2 ．1 植物组织培养技术概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21 ．2 ．2 月季组织培养研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。

21 ．2 ．3 植物体细胞培养研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯工⋯⋯．．．⋯⋯⋯．．61 ．2 ．4 存在的问题⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 11 ．3 研究内容与技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122 材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 42 ．1 材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 42 ．1 ．1 植物材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 42 ．1 ．2 主要试验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 42 ．1 ．3 培养基和培养条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 42 ．2 方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 52 ．2 ．1 现代月季快速繁殖体系的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 52 ．2 ．2 愈伤组织的诱导⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 62 ．2 ．3 愈伤组织分化培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172 ．2 ．4 细胞悬浮系的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 72 ．2 ．5 细胞悬浮系的再生⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯183 结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 03 ．1 月季快速繁殖体系的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 03 ．1 ．1 丛生芽诱导结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 03 ．1 ．2 组培苗生根诱导与移栽⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 13 ．2 现代月季愈伤组织的诱导⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 23 ．2 ．1 叶片愈伤组织的诱导⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 23 ．2 ．2 幼茎愈伤组织的诱导⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．：⋯⋯⋯：⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 63 ．2 ．3 愈伤组织的显微观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 93 ．3 现代月季愈伤组织的分化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 03 ．3 ．1 胚性愈伤组织的形成过程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 33 ．3 ．2 基因型和外植体对愈伤组织分化的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 43 ．3 ．3 培养基及激素对愈伤组织分化的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 43 ．3 ．4 光照条件对愈伤组织分化的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3 53 ．3 ．5 愈伤组织状态对愈伤组织分化的影响⋯⋯⋯．．j ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 6东北农业大学农学硕七学位论文3 ．3 ．6 继代次数对愈伤组织分化的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 73 ．4 细胞悬浮系的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 83 ．4 ．1 细胞悬浮系的启动⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3 83 ．4 ．2 细胞悬浮培养过程中P H 值的变化规律⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3 93 ．4 ．3 细胞悬浮系的生长特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 93 ．5 细胞悬浮系的再生培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 13 ．5 ．1 悬浮细胞愈伤组织的诱导⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 l3 ．5 ．2 悬浮细胞愈伤组织的分化培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 3z l 讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4 74 ．1 影响月季愈伤组织诱导和分化的因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 74 ．1 ．1 外植体与基因型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 74 ．1 ．2 培养基和培养条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 84 ．2 愈伤组织的分化途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 84 ．2 ．1 器官发生途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 84 ．2 ．2 体细胞胚胎发生途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 94 ．2 ．3 类原球茎发生途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4 94 ．3 现代月季体细胞培养的影响因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 94 ．3 ．1 悬浮培养起始物的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 94 ．3 ．2 细胞培养与P H 的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5 04 ．3 ．3 振荡培养转速的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 04 ．4 褐化现象的控制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 05 结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5 2致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 4参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 5附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．6 1攻读学位期间发表的学术论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6 3C o n t e n t s曼曼曼曼鼍鼍I_ ．,I 曼罡! 曼! 曼曼皇曼曼蔓C o n t e n t sC h i n e s eA b s t r a c t ⋯．⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··IE n g l i s hA b s t r a c t ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．I I I1I n t r o d u c t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11 ．1P u r p o s ea n ds i g n i f i c a n c eo f t h er e s e a r c h ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．j ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11 ．2P r o g r e s so fr e s e a r c h ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21 ．2 ．1P r o g r e s so f t i s s u ec u l t u r eo f p l a n t s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21 ．2 ．2P r o g r e s so f t i s s u ec u l t u r eo f r o s e ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21 ．2 ．3P r o g r e s so fs o m a t i ce e l sc u l t u r eo fp l a n t s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61 ．2 ．4P r o b l e m s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．111 ．3T h et e c h n i q u er o u t ea n dr e s e a r c hc o n t e n t s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 22M a t e r i a l sa n dm e t h o d s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142 ．1M a t e r i a l s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142 ．1 ．1P l a n t sm a t e r i a l s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 42 ．1 ．2P l a n t sm a t e r i a l s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 42 ．1 ．3M e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 42 ．2M e t h o d s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 52 ．2 ．1E s t a b l i s h m e n to f m i c r o p r o p a g a t i o no f m o d e mr o s e s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 52 ．2 ．2C a l l u Si n d u c e m e n t ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．162 ．2 ．3T h ec u l t u r eo fc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 72 ．2 ．4E s t a b l i s h m e n to f c e l ls u s p e n s i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 72 ．2 ．5C e l lS u s p e n s i o nr e g e n e r a t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·183R e s u l t sa n da n a l y s i s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。

2 03 ．1E s t a b l i s h m e n to f m i c r o p r o p a g a t i o no f m o d e mr o s e s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 03 ．1 ．1T h er e s u l t so fm u l t i p l es h o o ti n d u c t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 03 ．1 ．2R o o t i n gi n d u c t i o na n dt r a n s p l a n t i n go f a s e p t i cs e e d l i n g ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·2 13 ．2C a l l u si n d u c e m e n to fm o d e mr o s e s ⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 23 ．2 ．1C a l l u si n d u c e m e n to fl e a v e s ⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 23 ．2 ．2C a l l u si n d u c e m e n to f y o u n gs t e m s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 63 ．2 ．3T h em i c r o s c o p i co b s e r v a t i o no f c a l l u s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。

2 93 ．3C a l l u sd i f f e r e n t i a t i o no fm o d e mr o s e s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 03 ．3 ．1T h ef o r m a t i o np r o c e s so f e m b r y o g e n i cc a l l u s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”3 33 ．3 ．2T h ee f f e c to f g e n o t y p ea n de x p l a n t so nc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一3 43 ．3 ．3T h ee f f e c to fH o r m o n ea n dm e d i u mo nc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 43 ．3 ．4T h ee f f e c to fl i g h tc o n d i t i o n so nc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3 53 ．3 ．5T h ee f f e c to f c a l l u sc h a r a c t e r i s t i c so nc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一3 61 1 13 ．3 ．6T h ee f f e c to f s u b c u l t u r et i m e so nc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 73 ．4E s t a b l i s h m e n to f c e l ls u s p e n s i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一3 83 ．4 ．1T h ei n i t i a lc u l t u r eo f c e l ls u s p e n s i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3 83 ．4 ．2T h ev a r i a t i o no f P Hv a l u e si nt h ep r o c e s so f c e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 93 ．4 ．3T h eg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c so fc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．3 93 ．5C e l ls u s p e n s i o nr e g e n e r a t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4 13 ．5 ．1T h ec a l l u si n d u c t i o no f s u s p e n s i o nc e l l s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4 13 ．5 ．2T h ec a l l u sd i f f e r e n t i a t i o no f s u s p e n s i o nc e l l s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 34D i s c u s s i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4 74 ．1F a c t o r si nc a l l u si n d u c t i o na n d d i f f e r e n t i a t i o nO i l ．m o d e mr o s e s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 74 ．1 ．IG e n o t y p ea n de x p l a n t s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4 74 ．1 ．2M e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4 84 ．2T h ew a y so fc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 84 ．2 ．1O r g a n o g e n e s i sw a y s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”4 84 ．2 ．2S o m a t i ce m b r y o g e n e s i sw a y s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 94 ．2 ．3P r o t o c o r mw a y s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 94 ．3F a c t o r si ns o m a t i cc e l lc u l t u r eO i lm o d e mr o s e s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 94 ．3 ．1T h ei n i t i a t o rs e l e c t i o no f c e l ls u s p e n s i o n ⋯⋯⋯⋯⋯j ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 94 ．3 ．2T h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc e l lc u l t u r ea n dP H ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。

5 04 ．3 ．3T h ee f f e c to fo s c i l l a t i n gs p e e d s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 04 ．4T h ec o n t r o lo fb r o w n i n gp h e n o m e n o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“5 05C o n c l u s i o n s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5 2A c k n o w l e d g e m e n t s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5 4R e f e r e n c e s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 5A p p e n d i x ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”OlA r t i c l e sp u b l i s h e dd u r i n gs p e c i a l i z i n gt h ed e g r e eo fm a s t e r ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6 3书使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意学位论文作者签名：海参善日期：如J1 年多月争日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：谘岳葛日期：驯年6 月尸日导师签名：日期：洲彤月户摘要摘要现代月季是世界上最重要的观赏植物之一，其四季常开、香味浓郁、花色丰富，一直为众人所青睐，具有广泛的应用价值，是现代城市绿化中不可替代的材料我国北方由于气候原冈，缺乏可以广泛栽培并能露地越冬的现代月季品种当前在月季育种中存在的突出问题是现代月季遗传背景狭窄，传统育种方法周期过长，而且染色体数目及倍性差异造成远缘杂交不亲和与杂种的高度不育生物工程则为生物品种的改造开辟了新途径愈伤组织和体细胞是无性系变异和遗传转化的良好的受体材料，通过愈伤组织再生和体细胞培养可以获得无性系变异植株，而且体细胞融合为解决远缘杂交不育提供了一个很有潜力的新途径。

但是现代月季再生途径的建立还存在很大的困难，而且体细胞培养难度很大，体细胞培养获得再生植株的报道还很有限，因此本研究对促进月季的抗寒育种及其他性状的改良都具有重要的意义本研究通过探究影响现代月季快速繁殖和愈伤组织诱导再生的因素，并利用获得的愈伤组织建立细胞悬浮系，探讨了影响现代月季体细胞培养的各种因子，旨在建立起现代月季高效的快速繁殖体系、愈伤组织再生和体细胞培养技术体系，为以后导入抗寒等目的基因、体细胞无性系变异的筛选及原生质体培养和融合等遗传操作打下良好的基础本研究的主要结果如下：1 ．建立了5 个现代月季品种快速繁殖体系：l 号月季品种不定芽萌发和增殖的最佳培养基为：M S + 6 ．B A 2 ．5 m g ·L ～+ N A A 0 ．0 5 m g ·L ～，增殖率能达到4 ．2 ；2 号、6 号和8 号月季品种最佳培养基为：M S + 6 ．B A 2 ．0 m g ·L 一+ N A A 0 ．0 5 m g ·L 一，增殖率分别能达到3 ．6 8 、4 ．0 7 和4 ．2 ；9 号月季品种最佳培养基为：M S + 6 ．B A 2 ．0 m g ·L 一+ N A A 0 ．1 m g ·L - 1 ，增殖率可达到3 ．9 9 ；5 个月季品种无菌苗的最适生根培养基为：I ／2 M S + N A A 0 ．0 5m g ·L q 和1 ／2 M S + N A A0 ．1 m g ·L ～，生根率都可达8 0 ％以上：各品种无菌苗通过驯化炼苗，露地栽植成活率都可达8 8 ％以上。

2 ．筛选出5 个现代月季品种愈伤组织诱导最佳培养基l 号、8 号月季品种叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D 3 ．0m g ·L ～诱导率均可达到1 0 0 ．o o ％；2 号、6 号、9号月季品种叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D 2 ．0m g ·L - I + 6 ．B A 0 ．5m g ·L ～，诱导率分别可达到9 7 ．6 7 ％、9 8 ．6 7 ％、1 0 0 ．0 0 ％l 号、6 号月季品种幼茎诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D 3 ．0m g ·L ．1 ，诱导率分别可达到7 8 ．6 7 ％，8 4 ．3 3 ％；2 号月季品种幼茎诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D 2 ．0m g ·L ．1 ，诱导率可达到7 3 ．6 7 ％：8 号、9 号月季品种幼茎诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D 2 ．0 m g ·L d + 6 ．B A 0 ．5 m g ·L ～，诱导率分别为8 2 ．3 3 ％、8 0 ．3 3 ％3 ．筛选出4 个现代月季品种愈伤组织分化最佳培养基。

1 号品种叶片愈伤组织分化的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D O ．2m g ·L ～+ T D Z 9 ．0m g ·L 一+ G A 3 0 ．1m g ·L ．I ，分化途径为不定芽发生途径，分化率可达1 8 ．0 0 ％；6 号品种叶片愈伤组织分化的培养基为M S + 6 ．B A 0 ．1m g ·L 吐+ 2 ，4 ．D 1 ．0m g ·L 一+ T D Z 8 ．0m g ·L 一+ G A 3 0 ．1m g ·L ～，分化途径为不定芽发生途径，分化率可达2 2 ．0 0 ％；适合8 号品种叶片愈伤组织分化的培养基为1 ／2 M S + 6 ．B A 0 ．5m g ·L ．I + T D Z l 0 ．0东北农业火学农学硕l = 学位论文m g ·L ～+ G A 3 0 ．1m g ·L 一、M S + 2 ，4 ．D O ．2m g ·L ．1 + T D Z 9 ．0m g ·L 一+ G A 3 0 ．1m g ·L - I ，前者愈伤组织分化途径为胚状体途径，胚状体通过继代培养可形成再生植株，后者分化途径为不定芽途径，分化率分别为1 8 ．6 7 ％、2 1 ．3 3 ％，幼茎愈伤组织分化的最佳培养基为M S + T D Z 8 ．0m g ·L 一，分化途径为不定芽发生途径，分化率可达4 6 ．6 7 ％：9 号品种叶片愈伤组织分化的最佳培养基为M S + 6 ．B A 0 ．1m g ·L 一+ T D Z 9 ．0m g ·L ～+ G A 3 0 ．5m g ·L 一，分化途径为不定芽途径，分化率达到1 6 ．6 7 ％，幼茎愈伤组织分化的培养基为M S + 2 ，4 ．D O ．2m g - L ～+ T D Z 9 ．0m g ·L 一+ G A 3 0 ．1m g ·L 一，分化途径为胚状体途径，分化率可达3 5 ．3 3 ％。

4 ．以5 个月季品种的愈伤组织诱导培养基成分相同的液体培养基可建立起稳定的悬浮细胞系，悬浮系最佳的继代时间间隔为8 ．1 0 d ，悬浮系培养后4 ．8 天内的细胞生长旺盛，活性强，适宜用来进行细胞系的再生培养；不同基因型间月季悬浮系生长特性差异不显著5 ．以l 号、8 号和9 号三个品种的悬浮细胞可诱导出愈伤组织l 号品种悬浮细胞在固体培养基M S + 6 ．B A 0 ．1m g ·L ．1 + 2 ，4 ．D I ．0m g ·L ～+ K T 0 ．1m g ·L - l ，愈伤组织诱导率为2 2 ．0 0 ％；8 号品种悬浮细胞在同体培养基M S + 2 4 ．D 1 ．0m g ·L 以+ N A A l ．0m g ·L ～+ K T 0 ．5m g ·L 1 愈伤组织诱导率为2 7 ．3 3 ％；9 号品种悬浮细胞在固体培养基M S + 2 ，4 ．D 1 ．0m g ·L ～+ N A A l ．0m g ·L ．1+ K T 0 ．5m g ·L _ 愈伤组织诱导率为2 6 ．6 7 ％，悬浮细胞在液体培养基M S + 6 ．B A 0 ．5m g ·L _+ 2 ，4 - D 1 ．0m g ·L 一+ N A A 0 ．2m g ·L 。

愈伤组织诱导率仅为2 ．6 7 ％6 ．1 号品种悬浮细胞愈伤组织在培养基M S + 2 ，4 ．D O ．2m g ·L 一+ T D Z 9 ．0m g ·L 一+ G A 3 0 ．1m g ·L q 上可直接分化出不定芽，分化率可达3 2 ．3 3 ％；8 号晶种悬浮细胞愈伤组织在培养基M S + 2 ，4 ·D O ．2m g ·L ～+ T D Z 9 ．0m g ·L 一+ G A 3 0 ．1m g ·L ．I 上可分化出胚状体，分化率可达2 6 ．6 7 ％；9 号品种悬浮细胞愈伤组织在培养基M S + 6 - B A 0 ．1m g ·L - I + T D Z9 ．0 m g ·L ．1 + G A 3O ．5 m g ·L ．I 上可分化出胚状体，分化率为3 8 ．6 7 ％关键词月季；愈伤组织；体细胞培养：再生I IM o d e r nR o s e sC u l t i v a r sA b s t r a c tM o d e mr o s e ( R o s ah y b r i d aL ．) i so n ek i n do ft h em o s ti m p o r t a n to r n a m e n t a lp l a n t s ，w h i c hi sp o p u l a rb e c a u s eo ft h ec o l o r f u l ，f r a g r a n t , c o n c u r r e n tf l o w e r sw i t haw i d er a n g eo fa p p l i c a t i o n ．T h e ya r ei r r e p l a c e a b l em a t e r i a l sf o rl a n d s c a p i n gi nm o d e mc i t i e s ．D u et Oc l i m a t er e a s o n si nt h en o r t ho f C h i n a , t h e r ea l ef e wc u l t i v a r so f r o s e sc a r ll i v et h r o u g ht h ew i n t e r ．M o d e mr o s e sh a v ean a r r o wg e n e t i cb a s e ，a n dt r a d i t i o n a lb r e e d i n gm e t h o d sn e e dt ot a k eal o n gt e r m ，w h i c hd e l a y st h ed e v e l o p m e n to fr o s eb r e e d i n ga tp r e s e n t ．B i o e n g i n e e r i n go f f e r san e wa p p r o a c hf o rb r e e d i n gw o r k ．C a l l u sa n ds o m a t i cc e l la r eg o o dr e c e p t o rm a t e r i a l sf o rc l o n ev a r i a t i o na n dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ，t h r o u g ht h ec a l l u st i s s u er e g e n e r a t i o na n ds o m a t i ct r a i n i n gc a no b t a i nv a r i a b l ep l a n t s ，a n ds o m a t i cf u s i o np r o v i d e sap o t e n t i a ln e ww a y st os o l v ed i s t a n th y b r i d i z a t i o ni n f e r t i l i t y ．B u tt h ee s t a b l i s h m e n to fm o d e mr o s ec a l l u sr e g e n e r a t i v ea n ds o m a t i cc e l l sc u l t u r es t i l le x i s t sg r e a td i f f i c u l t y ，t h er e l e v a n tr e p o r t sa r es t i l lf e w ．T h e r e f o r e ，t h i ss t u d yh a sv i t a ls i g n i f i c a n c et op r o m o t et h ec o l d ·t o l e r a n c ea n do t h e rt r a i t sb r e e d i n g ．T h i ss t u d yd i s c u s s e dt h ef a c t o r st h a ta f f e c t e dc a l l u si n d u c e m e n ta n dr e g e n e r a t i o no fm o d e r nr o s e ，a n da c q u i r e de m b r y o g e n i cc a l l u s ，a n de s t a b l i s h e dc e l ls u s p e n s i o nb a s e do nt h ea c q u i r e dc a l l u s ，t h ef a t o r st h a ta f f e c t e ds o m a t i cc e l l sc u l t u r ea l s ow e r ed i s c u s s e d ．T h es t u d yi sa i m e dt oa c q u i r er e g e n e r a t e dp l a n t sf r o mc a l l u sa n ds o m a t i cc e ll s ，a n dp r o v i d eb a s ef o rg e n e t i cm a n i p u l a t i o ns u c ha sc o l d - r e s i s t a n ts p e c i e si m p r o v e m e n t ，s o m a t i cc e l lc l o n e sv a r i a b l es e l e c t i o na n dp r o t o p l a s tc u l t i v a t i o na n df u s i o n ．T h em a i nr e s u l t so f t h i ss t u d ya r ea sf o l l o w s ：1 ．E s t a b l i s h m e n to fm i c r o p r o p a g a t i o no ff i v em o d e mr o s e s ：T h eb e s tm e d i u mf o rt h eg e r m i n a t i o no fc u l t i v a r1a x i l l a r yb u da n ds h o o tm u l t i p l i c a t i o nw a s ：M S + 6 - B A 2 ．5 m g ’L 1 + N A A0 ．0 5 m g ‘L ”，t h er a t eo fp r o l i f e r a t i o nc a nr e a c h4 ．2 ；T h eb e s tm e d i u mf o rt h eg e r m i n a t i o no fc u l t i v a r s2 ，6a n d8a x i l l a r yb u da n ds h o o tm u l t i p l i c a t i o nW a s ：M S + 6 - B A2 ．0 r a g ·L q + N A A0 ．0 5 m g ‘L - 1 ，t h er a t eo fp r o l i f e r a t i o nc a nr e s p e c t i v e l yr e a c h3 ．6 8 ，4 ．0 7 ，4 ．2 ；T h eb e s tm e d i u mf o rt h eg e r m i n a t i o no fc u l t i v a r9a x i l l a r yb u da n ds h o o tm u l t i p l i c a t i o nW a s ：M S + 6 ·B A 2 ．0 r a g ·L _ + N A A 0 ．1m g ’L 一，t h er a t eo fp r o l i f e r a t i o nc a nr e a c h3 ．9 9 ；T h eb e s tr o o t i n gm e d i u m sf o rf i v e c u l t i v a r sw e r e1 ／2 M S + N A A 0 ．0 5m g ‘L ～a n d1 ／2 M S + N A A 0 ．1m g ·L ．1 ，r o o t i n gr a t ec a nb eu pt o8 0 ％；T h es u r v i v a lr a t eo fs t e r i l es e e d l i n g sc u l t i v a t e di nt h eo p e nc a nb eu pt o8 8 ％b yd o m e s t i c a t i o na n dt r a n s p l a n t i n g ．2 ．T h el e a v e sa n dy o u n gs t e m so ff i v ec u l t i v a r s ’s t e r i l es e e d l i n g sh a v eag o o dc a l l u si n d u c t i o na b i l i t y ．T h eb e s tm e d i u mf o rl e a v e sc a l l u si n d u c t i o no fc u l t i v a r s1a n d8i s ：M S + 2 ，4 ·D 3 ．0m g ·L ．J ，t h er a t e so fi n d u c a t i o nb o t hr e a c hl0 0 ．0 0 ％：T h eb e s tm e d i u mf o rl e a v e sc a l l u si n d u c t i o no fc u l t i v a r s2 ，6a n d8i s ：M S + 2 ，4 - D 2 ．0m g ’L ．‘+ 6 - B A 0 ．5m g ·L “，t h er a t eo fi n d u c a t i o nc a nI I I东北农业大学农学硕士学位论文r e s p e c t i v e l yr e a c h9 7 ．6 7 ％，9 8 ．6 7 ％，1 0 0 ．0 0 ％．T h eb e s tm e d i u mf o ry o u n gs t e m sc a l l u si n d u c t i o no fc u l t i v a r s1a n d6i s ：M S + 2 ，4 ·D 3 ．0m g ‘L - ’，t h er a t eo fi n d u c a t i o nc a nr e s p e c t i v e l yr e a c h7 8 ．6 7 ％，8 4 ．3 3 ％；T h eb e s tm e d i u mf o ry o u n gs t e m sc a l l u si n d u c t i o no fc u l t i v a r2i s ：M S + 2 ，4 ．D 2 ．0m g ·L ～，t h er a t eo fi n d u c a t i o nc a nr e a c h7 3 ．6 7 ％：T h eb e s tm e d i u mf o ry o u n gs t e m sc a l l u Si n d u c t i o no fc u l t i v a r s8a n d9i s ：M S + 2 ，4 - D 2 ．0 m g 。

L - l + 6 - B A 0 ．5 m g ·L ～，t h er a t eo fi n d u c a t i o nc a nr e s p e c t i v e l yr e a c h8 2 ．3 3 ％．8 0 ．3 3 ％．3 ．1 1 h ec a l l u so ff i v e c u l t i v a r sa l lc a nr e g e n e r a t e ，e x c e p t2c u l t i v a rw i t h o u to b t a i n i n gt h er e g e n e r a t i o ns e e d l i n g s ，t h eo t h e rf o u rc u l t i v a r sc a no b t a i n er e g e n e r a t i o ns e e d l i n g s ．T h eb e s tm e d i u mf o rl e a v e sc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o no fc u l t i v a r1i s ：M S + 2 ，4 ．D O ．2m g - L d + T D Z 9 ．0m g ·L q+ G A 3 0 ．1m g ‘L 一，t h ew a yo fd i f f e r e n t i a t i o ni sa d v e n t i t i o u sb u d s ，t h er a t ec a nr e a c h18 ．0 0 ％；T h eb e s tm e d i u mf o rl e a v e sc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o no fc u l t i v a r6i s ：M S + 6 ．B A 0 ．1m g ·L q + 2 ．4 ．D1 ．0m g ·L ．1+ T D Z 8 ．0m g ’L - 1 - I - G A 3 0 ．1m g ·L 一，，t h er a t ec a nr e a c h2 2 ．0 0 ％：T h es u i t a b l em e d i u m sf o rl e a v e sc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o no fc u l t i v a r8a r e ：l ／2 M S + 6 ．B A 0 ．5m g ·L ～+ T D Z l 0 ．0m g ·L - I + G A 3 0 ．1m g ·L da n dM S + 2 ，4 - D O ．2m g ‘L “+ T D Z 9 ．0m g ‘L “+ G A 3 0 ．1m g ‘L 一．t h ew a yo fd i f f e r e n t i a t i o no nt h ef i r s tm e d i u mi ss o m a t i ce m b r y o g e n s i sw h i c hc a nf o r mr e g e n e r a t i o ns e e d l i n g s ，t h es e c o n di sa d v e n t i t i o u sb u d s ，t h er a t e sc a nr e s p e c t i v e l yr e a c h18 ．6 7 ％a n d21 ．3 3 ％．t h eb e s tm e d i u mf o ry o u n gs t e m sc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o ni sM S + T D Z 8 ．0 m g ·L ．‘。

t h ew a yo fd i f f e r e n t i a t i o ni sa d v e n t i t i o u sb u d s ，t h er a t ec a r lr e a c h4 6 ．6 7 ％：T h eb e s tm e d i u mf o rl e a v e sc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o no fc u l t i v a r9i s ：M S + 6 一B A 0 ．1m g ‘L - ‘+ T D Z 9 ．0m g ‘L ．1 + G A 3 0 ．5m g ’L ．‘，t h ew a yo fd i f f e r e n t i a t i o ni sa d v e n t i t i o u sb u d s ，t h eb e s tm e d i u mf o ry o u n gs t e m sc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o ni sM S + 2 ．4 - D O ．2m g ·L 一+ T D Z 9 ．0m g ·L 一+ G A 3 0 ．1m g ‘L ～，t h ew a yo fd i f f e r e n t i a t i o ni ss o m a t i ce m b r y o g e n s i s ，t h er a t ec a nr e a c h3 5 ．3 3 ％．4 ．T h es t a b l ec e l ls u s p e n s i o no ff i v ec u l t i v a r sc a nb ef o u n d e do nt h el i q u i dm e d i u m sw h i c hh a v et h es a m ec o m p o s i t i o no fc a l l u si n d u c t i o n , t h eb e s tt i m ei n t e r v a If o rs u b c u l t u r ei s 8 ．10 d ．c e l l sh a sv i g o r o u sg r o w t ha n ds t r o n ga c t i v i t ya f t e r4 - 8 dc u l t u r e ，w h i c ha r es u i t a b l ef o rc e l lr e g e n e r m i o nc u l t u r e ；T h e r ea r en oo b v i o u sd i f f e r e n c e si nt h eg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c sb e t w e e nd i f f e r e n tr o s eg e n o t y p e s ．5 ．T h es u s p e n d e dc e l l so fc u l t i v a r s l ，8a n d9c a ni n d u c et h ec a l l u s ，t h ea b i l i t yo fc a l l u si n d u c t i o ni sl o w ．T h ec a l l u si n d u c t i o nr a t eo fc u l t i v a r sli s2 2 ．0 0 ％o nt h em e d i u mM S + 6 ．B A 0 ．1m g 。

L ．I + 2 ，4 - D1 ．0m g L 一+ K T 0 ．1m g L ～，t h er a t ei s5 ．3 3 ％o nt h el i q u i dm e d i u mM S + 6 ·B A 0 ．5m g ‘L 1 + 2 ，4 ·D 0 ．2m g ‘L 一+ K T 0 ．5m g ·L 1 ；T h ec a l l u si n d u c t i o nr a t eo fc u l t i v a r s8i s2 7 ．3 3 ％o nt h em e d i u mM S + 2 ，4 一D 1 ．Om g ‘L “+ N A A1 ．Om g ’L ～+ K T 0 ．5m g ·L ．1 ；T h ec a l l u si n d u c t i o nr a t eo fc u l t i v a r s9i s2 6 ．6 7 ％o nt h em e d i u mM S + 2 ，4 - D1 ．0m g ·L ．1 + N A A1 ．0m g ‘L 一+ K T 0 ．5m g ·L - ‘，t h er a t ei s2 ．6 7 ％o nt h el i q u i dm e d i u mM S + 6 ·B A 0 ．5m g 。

L q + 2 ，4 - D1 ．0m g ·L ．‘+ N A A 0 ．2m g ·L - 1 ．6 ．T h ec a l l u si n d u c e db ys u s p e n d e dc e l l so fc u l t i v a r s1c a nd i f f e r e n t i a t ea d v e n t i t i o u sb u d so nt h em e d i u mM S + 2 ，4 - D O ．2m g ’L 叫+ T D Z 9 ．0m g ·L ～+ G A 3 0 ．1m g ·L ～，t h er a t ec a r lr e a c h3 2 ．3 3 ％：T h ec a l l u si n d u c e db ys u s p e n d e dc e l l so fc u i t i v a r s8c a nd i f f e r e n t i a t es o m a t i ce m b r y o g e n s i so nt h em e d i u mM S + 2 ，4 - D 0 ．2m g ‘L 叫+ T D Z 9 ．0m g ·L 一+ G A 3 0 ．1m g ‘L ～，t h er a t ec a nr e a c h2 6 ．6 7 ％；T h cc a l l u si n d u c e db ys u s p e n d e dc e l l so fc u l t i v a r s9c a nd i f f e r e n t i a t es o m a t i ce m b r y o g e n s i so nt h eVS u p e r v i s o r - P r o f ．C h eD a i d i现代月季( R o s ah y b r i d aL ．) 是蔷薇科( R o s a c e a e ) 蔷薇属( R o s aL ．) 植物，是世界上最重要的观赏植物之一，其四季常开、花型多样、花色丰富，一直为众人所青睐，具有广泛的应用价值，既可以做盆栽、切花、花镜、花边，也可以做地被、主体花架、道路隔离带绿化等，作为中国的十大传统名花之一，月季也是很多城市的市花。

现代月季品种繁多，近一二百年里，已培育出2 5 0 0 0 多个新品种，组成庞大的现代月季杂交品种群( Y o n ga n dS c h o r r , 2 0 0 7 ) 现代月季系统分为六大类：1 ．杂种香水月季( 杂种茶香月季) H y b r i dT e aR o s e s ( H T ) ；2 ．丰花月季( 聚花月季) F i o r i b u n d aR o s e s ( F I ．) ；3 ．壮花月季( 人姊妹月季) G r a n d i f l o r aR o s e s ( G r ．) ；4 ．杂种长春月季( 杂交长春月季) H y b r i dP e r p e t u a lR o s e ，R e m o n t a n tR o s e s ( H p ) ；5 ．微型月季M i n i a t u r eR o s e s( M i n ．) ：6 ．藤月季( 藤本月季、蔓性月季) C l i m b e r & R a m n b l e r ( C I ．) ( 陈俊愉，2 0 0 1 ) 现代月季经过反复的杂交，在花型、花色等方面都有很大的突破，但是由于长期的定向选育，很多现代月季品种已经失去馥郁的香味，综合抗性降低，易感病虫害等。

目前现代月季育种主要存在着以下几个问题：( 1 ) 传统杂交方法具有局限性主要表现在基因资源有限，染色体数目以及倍性差异使远缘杂交难以成功；生长一致性、开花同时性等多基因控制性状难以改良等此外月季作为多年生灌木，育种周期较长 2 ) 只注重对外观性状的改良，忽视了内在性状在月季品种选育过程中，育种学家多只重视芽形、花形、花径、瓣数和茎长等外观性状的改良，并且杂交种选择标准也趋于一致，导致优良的内在性状，如高生活力、瓶插寿命以及抗逆性等未得到保留，在筛选的过程中丢失了 3 ) 遗传背景相对狭窄高度近亲杂交导致后代杂交不亲和、杂种胚畸形败育等现象( D ev r i e se ta 1 ．，1 9 9 5 ) 目前，2 0 0 多个野生蔷薇种中，大部分仍处于野生状态，参与现代月季品种群的仅有1 5 个种，其中有1 0个左右原产中国，它们是：月季花假．c h i n e n s i s ) 及其变种、变型、品种；光叶蔷薇( 尺．w i c h u r a i a n a ) 、香水月季僻．o d o r a t a ) 及其品种、巨花蔷薇但．g i g a n r e a ) 、野蔷薇( R ．m u l t i f l o r a ) 、硕苞蔷薇( 足b r a c r e a r a ) 、黄蔷薇( R ．h u g o n 括) 、密刺蔷薇( R ．p i m p i n e l l i f o l i a ) 、血蔷薇( 华西蔷薇R ．m o y e s i O 、玫瑰( 尺．r u g o s a ) 及其变种、变型、品种( 陈俊愉，2 0 0 1 ) 。

1 ．1 研究的目的与意义东北地区冬季寒冷漫长，生长季短，城市绿化可利用的植物种类少，可利用的植物品种单一，且绿化成本较高，如何利用现有条件，改善目前的城市绿化水平较低的状况，培育出适应东北地区生长的同林绿化植物是目前东北地区城市绿化和发展花卉业的重要课题现代月季花期长、花色艳丽，宜做花坛、花境、基础种植或绿篱刚，也适于草坪、庭院等处栽植藤本月季还可供攀缘、绿化棚架、门廊等很多现代月季栽培品种为世界著名的切花，还有许多适于盆栽的品种，在园林绿化中应用非常广泛但在东北地区，尤其是在黑龙江地区，能够露地越冬的现代月季品种还屈指可数，因此，培育出能够在东北地区露地越冬的现代月季品种，对丰富东北地区吲林绿化植物资源和东北地区周林绿化具有重要的意义现代月季品种的培育主要是通过杂交的手段得到的现代月季的杂交育种有两种方式，即传统的品种间杂交和种间或变种间进行远缘杂交已知的月季栽培品种有2 万多个，其中东北农业大学农学硕J j 学位论文8 0 ％是通过品种间的杂交得到的，但传统育种方法育种周期过长，限制了月季育种的发展，而且现代月季遗传背景狭窄，品种间杂交无法向月季群体中引入新的遗传信息，其育种潜力有限，如抗病虫害抗旱抗寒，这些是品种间杂交难以解决的。

远缘杂交作为月季育种上一种有所突破的重要途径重新被人们重视起来，通过杂交很少的原始种类就能创造出许多不同的类型，但月季染色体数目及倍性差异造成远缘杂交不亲和与杂种的高度不育，成为限制月季育种发展的又一个瓶颈生物工程为现代月季品种的改造开辟了新途径，把某些抗性或其他优良性状基因导入原来不具备这些性状的植株体内，可以在较短时间达到改良品种的目的，近年来随着分子生物学的迅猛发展，许多研究者开始借助生物技术，如体细胞无性系变异、原生质体融合、遗传转化技术改良现代月季的某些品质，生物技术作为月季育种的新方法虽然刚刚起步，已展现出巨大发展前景愈伤组织和体细胞是体细胞无性系变异和遗传转化的良好的受体材料，通过愈伤组织再生和体细胞培养可以获得无性系变异植株，而且体细胞融合为解决远缘杂交不育提供了一个很有潜力的新途径但是现代月季再生途径的建立还存在很大的困难，而且体细胞培养难度很大，体细胞培养获得再生植株的报道还很有限，冈此本研究对促进月季的抗寒育种及其他性状的改良都具有重要的意义本研究通过探究影响现代月季离体再生的因素，并利用获得的愈伤组织建立细胞悬浮系，探讨了影响现代月季体细胞培养的各种冈子，旨在建立起现代月季高效的再生体系和体细胞培养技术体系，为以后导入抗寒等目的基因、体细胞无性系变异的筛选及原生质体培养和融合等遗传操作打下良好的基础，最终培育出优良的抗寒现代月季品种。

1 ．2 研究进展1 ．2 ．1 植物组织培养技术概述以植物细胞全能性为理论依据而发展起来的植物组织培养技术是指：在人工预知的控制条件下，在含有营养物质和植物生长凋’，剂等成分的培养基中，植物的器官、组织或细胞生长、分化，形成完整植株的过程( 乔拉，2 0 0 4 ) 自1 9 0 2 年德国植物生理学家H a b e r i a n d t 尝试进行植物组织离体培养，并提出离体培养的植物细胞具有通过胚胎发生途径而发育成完整植株的潜在能力以来，经过一百多年的研究，植物组织培养技术已日臻完善目前植物组织和细胞培养工作主要围绕以下几个方面进行：利用组织培养技术保存优良种质，以及植物快速繁殖( 管道平等，2 0 0 6 ) ；利用基冈工程和细胞：[ 程手段对植物进行舳种改良( 马和平等，2 0 0 5 ) ；在药用植物组织细胞培养方面则集中于天然产物的规模化生产等( 黄璐琳等，2 0 0 6 ) 1 ．2 ．2 月季组织培养研究进展为了进行基因转化、突变育种、快速繁殖和品种保存，必须建立植株的再生系统1 9 6 7年H i l l 首次报道月季的组培再生器官研究，随后又有多篇论文报道：在‘S o r a y a ’、‘B a c c a r a ’等品种上实现了通过体细胞胚状体发生雨I 器官发生途径再生完整植株直至开花。

R o u t 等( 1 9 9 9 ) 对国外近年来月季生物技术的研究成果进行了概述植株的再生一般经历从愈伤诱导、愈伤分化( 体细胞胚状体发生或器官发生) 、胚状体成熟萌发或芽的发育、到植株再生、2的繁殖和诱导幼苗生根Z i e s l i n 等( 1 9 7 6 ) 报道细胞分裂素有利于提高丛生芽的数量，但也增加了诱发花器官败育或退化的频率而B r e s s a n ( 1 9 8 2 ) 研究发现，采用6 - B A 质量浓度为0 ．0 3 ．0 ．3m g ．L ’1 的M S 培养基时可促进‘G o l dG l o w ’侧芽的发育，但当B A 质量浓度超过O ．3m g ·L 1 则显著推迟芽萌发，毕艳娟( 1 9 9 6 ) 也报道了低浓度的细胞分裂素( B A 、Z T ) 有利于提高月季的萌芽率D o u g l a s 等( 1 9 8 9 ) 以丰花月季品种‘Q u e e nE l i z a b e t h ’的侧芽、微型月季品种‘S u n b u r s tR e d ’、‘T o yC l o w n ’和地被月季品种‘F i o n a ’的顶芽为外植体，接种于M S + 6 - B A1 ．0m g ·L - 1 + N A A0 ．1m g ·L - l + G A 3O ．1m g ·L ．1 的培养基上，则每个培养周期其平均芽的增殖数分别为5 ．1 ，3 ．1 ，1 ．3 ，2 ．5 。

在月季芽萌动和增殖过程中附加B A P ( 1 ．O ．1 0 ．0m g ·L _ 1 ) 是必须的( H a s e g a w a ,19 8 0 ；W u l s t e r 等，19 8 0 ) ，只有少数报道在月季芽增殖过程中使用T D Z ( B a r n a 等，19 9 5 ；K u m a r等2 0 0 1 ) 不同种类的细胞分裂素对月季不定芽增殖的影响也不同M a r c e l i s 等( 1 9 9 5 ) 在添加相同浓度( 0 ．4 4 1 a m o l ·L _ ) 的细胞分裂素B A 、Z T 、K T 、Z R 、2 i P 、i p A 研究结果表明，K T 实际上对茎增殖没有多少影响；而B A 、Z T 、Z R 都可显著促进芽的重量和长度增加；2 i P 和i p Af虽也可促进芽的形成，但效果不如B A 、Z T 、Z R 的明显细胞分裂素配合一定的生长素可共同促进月季侧芽的萌发与生长，最常用的是N A A V i j a y a 等( 1 9 9 1 ) 发现B A P 是最有效的芽增殖调控因子，并指出B A P 与N A A 配合使用增殖效果好于I A A 和I B A 。

在6 - B A 质量浓度相同的情况下，随N A A 质量浓度的升高( O ．0 5 ．0 ．2 0m g ·L ．1 ) 月季小芽生长速度加快但N A A用量同时会影响芽增殖速度，当N A A 用量达0 ．1 m g ·L 以以上时，芽增殖的速度有下降趋势培养基中添加蔗糖有增加丛芽数量的作用，加入低浓度的G A 3 能进一步改善芽繁殖，9 5 ％的外植体能产生7 个以上的丛生芽( 林玉红，1 9 9 4 ) ，F e E D D H A 代替F e E D T A 能提高月季‘M o n e y w a y ’丛生芽叶绿素的含量，减少萎黄病的发生，从而促进芽体的生长( T h e o 等，1 9 9 4 ) 壮苗培养基一般是在M S 培养基中添加更低浓度的6 - B A 和N A A 何松林等( 1 9 9 6 ) 在现代月季品种‘萨蔓莎’生根培养基中添加I A A ，I B A 和N A A 均可有效诱导根的形成，其中以I ／2 M S + I A A1 ．0m g ·L ～，1 ／2 M S + I B A0 ．5m g ·L ．1 ，1 ／2 MS + N A A0 ．5m g ·L _ 的诱导效果较好。

说明低盐分的培养基和低浓度的生长素有利于诱导根的形成月季的生根受基因型影响较大( H o m 等，1 9 9 2 ) G e n o u d 等( 1 9 9 9 ) 发现一定强度的光照( 光强为1 0 0 I ．t m o l1 1 1 七S - I ) 能够增强生根阶段月季小植株的光合作用，对光化学过程也没有影响，但当光强达到3 0 0 肛m o l m 心S d时，则会造成光抑制，影响植物的生长；P a t i 等( 2 0 0 5 ) 研究发现液体培养能有效提高香水月季品种‘R o s ad a m a s c e n e ’和‘R o s ab o u r b o n i a n a ’的生长和发育，特别是对其生根率有显著效果1 ．2 ．2 ．2 器官发生途径植株再生器官发生途径是指在组织培养过程中，再生植株通过分生中心直接分化器官最终形成完整植株的过程这种发生途径通常有两种方式：器官直接发生不定芽途径和器官间接发生不定芽途径( 李浚明，2 0 0 2 ) 月季器官直接发生不定芽的报道还不太多L l o y d 等( 1 9 8 8 ) P 以月季品种‘R o s ap e r s i c a ×x a n t h i n a ’的离体叶、根以及‘R ．1 a e v i g a t a ’和‘R ．w i c h u r a i a n a ’的离体叶为外植体诱导不定芽，结果发现添加适当浓度的B A P 和N A A 的培养基均能诱导不定芽发生，_ _ _ _ j j j _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。

_ _ _ _ _ _ ——东北农业人学农学硕士学位论文但随着继代次数的增加，不定芽发生能力降低，且继代1 2 周后，终止产生不定芽任桂芳等( 2 0 0 4 ) 以月季的叶片为外植体，通过直接器官发生途径建立了月季植株再生体系，从2 4个现代月季品种中的1 2 个品种中得到再生植株，再生率高达4 6 ．5 ％，并指出基因型、植物生长调节剂组合、暗培养时间及叶片的幼嫩程度均对再生结果影响较大高莉萍等( 2 0 0 5 ) 以月季“萨蔓莎”试管苗的小叶为外植体，在含1 ．5m g ·L 1 T D Z 和O ．0 5m g ·L d N A A 的M S 培养基上黑暗培养8d 后转入含0 ．5m g ·L ‘1B A 和0 ．0 1m g ·L - 1N A A 的M S 培养基光下培养，再生效果最好，小叶外植体和复叶柄的再生率分别为5 1 ．8 ％和1 0 ％P a t i 等( 2 0 0 4 ) 也发现R o s ad a m a s c e n e 的叶在I ／2 M S + T D Z1 ．5m g ·L ．1 + N A A0 ．0 5m g ·L ．I 诱导后转入M S + B A P 0 ．5m g ·L ．1 + N A A 0 ．0 1m g ·L ．1 可以再生不定芽，且附加A g N 0 3 有助于提高再生率，并且观察到不定芽起源于叶柄部位。

切花月季‘L o v e ’，‘P r e s t o ’，‘Z o n i a ’和‘T i n e k e ’在1 ／2 M S + T D Z 6 ．8 p ．m o l ·L “+ N A A 0 ．2 7 1 ．t m o l ·L 1 的培养基上，可从叶片直接再生不定芽，晶种不同，分化情况不同，最大发生率是在叶片基部( 7 0 ％．1 0 0 ％) 并n n t ‘鞘基部( 2 5 ％．1 0 0 ％) ，加入A g N 0 3 可以缩短不定芽发生时间，提高不定芽再生频率( D u b o i s 等，l9 9 6 ) 器官间接发生不定芽途径是指首先住外植体的切1 2 处形成愈伤组织然后进行器官分化产生大量的不定芽，最后形成许多小植株通过愈伤组织再生植株一般需要愈伤组织诱导和不定芽分化两个步骤，这样经愈伤组织形成再生芽的周期较跃，且再生率较低激素、基因型及外植体类型等是影响愈伤生成与分化的重要因素H i l l ( 1 9 6 7 ) 最早报道从杂交香水月季( H y b r i dT e aR o s e ) 的茎上诱导了愈伤组织，但实验结果只到芽原基R o u t 等( 1 9 9 1 ) 以c L a n d o r a ’为材料，在添] J n B A 和N A A 、2 ，4 ．D 的M S 培养基上，a l - 夕b 植体在接种7 - 1 2d 后，在近轴面的叶柄和中脉处产生愈伤，愈伤组织诱导频率高达9 2 ％；茎外植体在接种1 5 - 2 0d 后，切端处产生愈伤，频率为7 6 ％。

生长素种类和浓度对愈伤产生能力的影响同样很大早期实验多采用N A A 结合B A P ( 或B A ) 等，近年来多采用2 ，4 ．D ，但2 ，4 ．D 对愈伤的诱导效果因月季的基因型而异( 李进等，2 0 0 7 ) 对于R ．c h i n e n s 括m i n im a c v ．‘R e dS u n b l a z e ’而言，当浓度从l1 ．3 p , m 0 1 ．L 1 增加到4 5 ．2 1 ．t m o l ·L ～，愈伤的诱导率提高了，随后当2 ，4 ．D 再增加，愈伤的诱导频率降低( L i 等，2 0 0 2 ) 与以上实验结果不同，K i n t z i o s 等( 1 9 9 9 ) 则证明2 ，4 ．D 对愈伤诱导有负影响作川，其原冈可能是因为实验采用的外植体是成熟叶片月季的愈伤诱导与分化受基因型影响特别人L l o y d 等( 1 9 9 8 ) 以M S 为基本培养基，添加低浓度的6 - B A 和N A A ，对R ．p e r s i c a ×x a n t h i n a ，R ．h y b r i d a ‘C l a r i s s a ’，R ．h y b r i d a ‘D a m e o fS a r k ’和R ．r u g o s a ‘S c a b r o s a ’的愈伤发生能力进行研究，发现只有R ．p e r s i c a ×x a n t h i n a 的节问能产生愈伤，愈伤组织脆性，呈淡黄绿色。

K u n i t a k e 等( 1 9 9 3 ) 研究了R o s ar u g o s aT h u n b ．，R ．m u l t i f l o r a ，R ．a l b aC V , S e m i p l e n a ，R ．h y b r i d aC V ．D u p l e s 和R ．h a r 括o n H ×R ．s p i n o s i s s i m a 的未成熟种子的愈伤发生能力，发现只有R o s ar u g o s aT h u n b ．能产生愈伤组织在月季上间接不定芽再生植株的报道常用外植体为根、节间、叶片、叶柄等A r e n e 等( 1 9 9 3 ) 详细地调查了R ．h y b r i d aC V ．M e i m t r a l 不同外植体的愈伤诱导率，不同外植体愈伤产生的能力不同，叶为9 0 ％，根为7 0 ％，节间为5 5 ％，花药为1 9 ％，其它花器官部位如花瓣、花萼、子房和花托为1 6 ％月季从愈伤组织问接诱导不定芽再生率通常不高，L i 等( 2 0 0 2 ) 从现代月季C a r e f r e eB e a u t y的叶片愈伤上再生不定芽，器官型愈伤诱导率为5 5 ．3 ％。

愈伤不定芽再生率只有3 ．3 ％并且4引言非常受基因型的限制，具有器官发生能力的愈伤组织也无法继代增殖，因此，此再生途径的应用有一定的局限性( 高莉萍等，2 0 0 5 ) 1 ．2 ．2 ．3 体细胞胚胎发生途径植株再生成功的体细胞胚状体发生体系的建立将有助于月季的试管苗快繁、冷藏保存、人工种子的生产和基因的转化操作等等V a l l e s 幂U B o x u s ( 1 9 8 7 ) 首次从体细胞胚状体得到再生植株多年的研究证明体细胞胚状体的发生是月季微繁殖潜在的非常有效的方法( 李进等，2 0 0 7 ) 品种、外植体及培养条件等对愈伤组织的诱导、体细胞胚的发生以及再生植株的形成有重要影响，其中基冈型、外植体及激素是最重要的影响因素M u r a l i 等( 1 9 9 6 ) 调查2 2 个品种发现，只有2 个品种能进行体细胞胚状体的发生诱导D eW i t 等( 1 9 9 0 ) 也发现在供试的7 个品种中，只有‘D o m i n g o ’和‘V i c t o r yB r o w n ’具有产生体细胞胚状体的能力K i n t z i o s 等( 1 9 9 9 ) 以四个月季品种‘B a c c a r a ’、‘M e r c e d e s ’、‘R o n t o ’和‘S o r a y a ’的老叶为外植体诱导体细胞胚，结果仅‘S o r a y a ’的叶片成功诱导出体细胞胚，且继代于相同的培养基上体胚发育成球形胚、心形胚以及鱼雷形胚。

表明月季的体细胞胚状体发生能力与基因型的关系密切N o r i e g a 等( 1 9 9 1 ) 希E J 用了花丝、花瓣、叶片、芽尖、雌蕊等各种外植体，最后只有花丝再生成功R o u t 等( 1 9 9 1 ) 以杂交月季的幼嫩叶片和茎段为外植体，在1 ／2 M S + 6 ．B A0 ．5 m g ·L ．‘+ N A A l m g ·L - 1 + 2 ，4 一D0 ．5 ·2 ．0m g ·L 1 + 蔗糖3 0g - L 一诱导培养基上诱导出愈伤组织，将生长良好的愈伤组织转至1 ／2 M S + 6 ．B A0 ．5 m g ·L ．‘+ N A A 0 ．0 1m g ·L 1 斗G A 3O ．1 m g ·L ．’+ 脯氨酸2 0 0 ．8 0 0 m g ·L d 培养基上培养8 周后形成胚性愈伤，将胚性愈伤在1 ／2 M S + 6 ．B A 0 ．5m g ·L ．‘+ G A 3 0 ．1 m g ·L 一+ a d e n i n es u l p h a t e1 0 m g ·L d 培养基上培养，结果约有1 2 ％的子叶期胚形成体细胞胚再生的基本培养基有M S 、1 ／2 M S 、B 5 、S H等。

专为木本植物组织培养设计的W P M 培养基现在在很多小本植物上已经被上述培养基替代，在月季上E s t a b r o o k s 等( 2 0 0 7 ) 也发现其效果不! t 1 ] M S 培养基诱导愈伤组织的激素有6 ．B A ，N A A ，2 , 4 ．D ，T D Z 等愈伤组织诱导过科中，单独使用细胞分裂索，不易形成愈伤组织，加入N A A 或2 ，4 ．D ，易形成愈伤组织2 ，4 ．D 是体胚诱导中最有效的激素，尤其是在胚性愈伤启动上( N o r i e g a 等，1 9 9 1 ：M u r a l i 等，1 9 9 6 ；M a r c h a n t 等，1 9 9 6 等；L i 等2 0 0 2 ) 单独使用2 ，4 - D 时，浓度太大，愈伤组织发生率下降，若在2 ，4 ．D 中添加低浓度的B A 有利于愈伤组织的诱导，但B A 浓度过高，则抑制愈伤组织的形成( 郑玉梅，2 0 0 3 ；刘会超等，2 0 0 7 ) M a r c h a n t 等( 1 9 9 6 )发现先在较高浓度的2 ，4 ．D ( 5 m g ·L ．1 ) 培养基上预培养1 4 天后转入较低浓度的2 ，4 - D ( 3 m g ·L “)培养基上有助于胚性愈伤的诱导。

V a n d e rS a l m 等( 1 9 9 6 ) 证明2 ，4 ．D 对诱导R ．p e r s i c a x x a n t h i n a和尺．‘M o n e y w a y ’产生愈伤是非常必要的，将诱导的愈伤转移到去除激素的培养基上则产生体胚，而在愈伤诱导时附j J I ] 6 ．B A 贝I ] 抑制后期愈伤的分化但也有报道等指出2 ，4 ．D 会抑制愈伤组织的诱导( K i n t z i o s 等，1 9 9 9 ) 可能不同月季品种对2 ，4 ．D 的反应不同最近有人报道一种新合成的激素2 ，4 ，5 ．T ( 2 ，4 ，5 ．t r i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d ) 较2 ，4 ．D 更有利于胚性愈伤和体胚的诱导( E s t a b r o o k s 等，2 0 0 7 ) H s i a 等( 1 9 9 6 ) 、L i 等( 2 0 0 2 ) 在‘C a r e f r e eB e a u t y ’上证明T D Z 有提高体细胞胚状体发生的作用研究发现T D Z 较6 ．B A 有时更有利- 丁．体胚形成，且加入G A 3 可以提高体胚诱导率。

暗培养中，A B A ，G A ，有利于某些品种的体细胞胚分化成熟( N o r i e g a 等，1 9 9 1 ；D h o m 等，2 0 0 1 ) 在培养基中添加肌醇、B 1 2 年1 1 8 6 等有机物有利于愈伤组织的生长，添加烟酸和半胱氨酸有利于球形胚的生长，而泛酸、生物素和谷氨酸则抑制球形胚的形成若在体细胞胚诱导过程中加入脯氨酸则有利于体细胞胚的发育；无脯氨酸，体细胞胚不发育，5东北农业人学农学硕士学位论文变小在前期培养时加入L ．脯氨酸，后除去脯氨酸，可以刺激体细胞胚的发育，同时降低畸形率( 郑玉梅，2 0 0 4 ) 体细胞胚的诱导还依赖于碳水化合物的类型和浓度( B o u t 等，1 9 9 9 ) 在H s i a 等( 1 9 9 6 ) 的研究中，在‘C a r e f r e eB e a u t y ’中，lll m M 的葡萄糖有利于器官型和体细胞型的愈伤形成，如果提高浓度，则抑制器官型愈伤的形成，而蔗糖浓度不同对于胚性愈伤及器官型愈伤的形成没有明显区别1 ll m M 的葡萄糖有利于‘B a b yK a t i e ’胚性愈伤的形成，而对器官型愈伤没有明显的效果。

影响体细胞胚再生的培养条件还有有温度、光照等K i n t z i o s 等( 1 9 9 9 ) 研究中指出，体细胞胚性愈伤诱导时5 0 1 1 m o lm 五s 以光强比高光密效果好，光太强抑制胚性愈伤的形成，但是较高的光强对体胚后期的成熟萌发却是必须的，否则体胚成熟萌发率低，且畸形胚多R o u t 等( 1 9 9 1 ) 在1 ／2 M S + B A 2 ．2 p M + G A 0 ．3 + 硫酸腺嘌呤2 4 ．7 p M _ ．E 诱导体细胞胚发芽时，若在光下培养，体细胞胚变绿，但没有发芽；若先进行4 天的8 ±1 ℃的低温下培养，然后在光下培养，1 2 ％的体细胞胚发芽S a l m 等( 1 9 9 6 ) 指出，缩短愈伤诱导时间，可以提高器官分化率R o b e , s 等( 1 9 9 6 ) 将外植体在4 " C 培养2 周，可以将发芽率由1 2 ％提高到2 4 ％M a r c h a n t等( 1 9 9 6 ) 在S H 培养基添加B A 和I B A ，并经低温处理，可以促进体细胞胚的发芽目前在很对品种上取得了体细胞胚再生植株，但是～般再生率较低，且再生周期长，很多再生周期达18 周( R o m 等，1 9 9 1 ) 以上，甚至达1 6 个月( D eW i t 等，1 9 9 0 ) 。

L i 等( 2 0 0 2 )发现品种‘R e dS u n b l a z e ’外植体胚性愈伤再生率只有6 ．6 ％目前的试验表明月季体细胞胚的萌发都需要培养基中同时含有生长素和细胞分裂素，但是和其它小本植物一样，萌发仍是比较凼难的D o h m 等( 2 0 0 1 ) 报道体胚的萌发是零星发生的为提高萌发效率采取的措施主要是强光照( K i n t z i o s 等，1 9 9 8 ) 、低温平I I A B A 处理R o u t 等( 1 9 9 1 ) 报道胚性愈伤在8 ℃下进行4 d 的预处理，体胚萌发频率从0 提高至2 ％B A 和M e l a ( 月桂酸甲酯) ( S a r s a n 等，2 0 0 1 ) ，碳源和渗透压调：1 ，物质对体细胞胚的成熟和萌发也会产生影响( C a s t i i l o na n dK a m o ，2 0 0 2 ) 而D o h m 等( 2 0 0 1 ) 发现体胚直接萌发成株萌发率低，但胚可以通过形成不定芽再生植株，在月季‘H e c k e n z a u b e r ’上1 0 0 ％的体胚再生出不定芽1 ．2 ．3 植物体细胞培养研究进展植物细胞培养是指对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞( 或小细胞团) 进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。

1 9 0 2 年，H a b e r l a n d t 根据细胞理论人胆地提出：高等植物的体细胞，可以不断分割，直至单个细胞的论言预言体细胞在适宜条件下，具有发育成完整植株的潜在能力1 9 3 4 年，W h i t e 将甭茄根尖细胞离体培养，得到一个活跃分裂的单细胞无性系1 9 5 3 年，M u i r 将烟草和万寿菊的愈伤组织，转移剑液体培养基中，放在摇床上振荡，获得由单细胞或细胞聚集体组成的细胞悬浮液而且可以继代增殖从而开创了单细胞培养技术，1 9 5 8 年S t e w a r d 等人首次由胡萝卜细胞悬浮培养经体细胞胚胎发生途径获得完整的再生植株，标志着细胞悬浮培养的真正开始1 0 0 年来随着培养基的研制和培养技术的发展，己经从4 0 0 多中植物中分离出细胞，不仅可以通过细胞的再分化生成完整的植株，而且可以通过细胞培养获得6 0 0 多种人们所需要的各种物质植物细胞培养己经建立起专门技术，形成新的学科体系木本植物的悬浮细胞培养起步较晚，1 9 8 1 ．1 9 8 2 年，R a d o j e v i c 成功地进行了欧洲榛子泡桐的悬浮细胞培养，并得到了再生植株( 陈正华，1 9 8 5 ) 。

美[ ] D u r z a n 禾l G u p a t a ( 1 9 8 9 ) 利用了白云杉、火6引言皇曼曼曼曼鼍曼曼鼍曼曼皇! 鼍皇曼曼曼烹曼! 曼蔓曼! ! ! 曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼皇寰皇鼍曼鼍舅皇皇曼璺曼曼曼曼蔓i mml , m 一量曼曼鼍! 曼皇曼炬松、乔松的悬浮培养，亦得到了胚状体印度C u r r i n d e rS ．C h e e m ( 1 9 8 7 ) 利用缘毛杨4 0 年生大树上嫩叶诱导的愈伤组织进行悬浮培养，得到了再生植株近年来一些科学家正将这一技术应用于植物品种的改良，使人们认识到要获得遗传的多样性，悬浮细胞培养技术确实是一个新的手段植物悬浮培养的细胞分散性好，细胞形状及细胞团人小也大致相同，并且细胞生长迅速，发育重复性好，容易控制等优点，被广泛用于细胞学、生理学、发育生物学及遗传学、生物化学、分子生物学研究悬浮培养不仅可直接应用于原生质体的分离、杂交、基因转移和生产次生代谢物等，还可在短期内在细胞水平筛选出预期突变体总之，悬浮细胞培养技术已经成为植物生物技术中最常用的手段之一( 路铁刚等，1 9 9 5 ；C a l h e i r o s 等，1 9 9 4 ) 。

在我国，木本植物悬浮培养直到2 0 世纪9 0 年代初期才有再生植株的报道；张绮纹等( 1 9 9 5 )利．} } j | 细胞悬浮培养技术成功的筛选出群众杨耐盐体细胞变异体的完整植株2 0 世纪7 0 年代后人们看到了用细胞生产次生代谢产物的潜力，大量人力物力的投入使细胞悬浮培养技术得到快速发展1 ．2 ．3 ．1 体细胞的获得植物细胞可以直接从外植体中分离达到从外植体直接分离植物细胞的方法通常有机械法和酶解法两种1 9 6 5 年B A L L 等人首次从花生成熟叶片中直接分离达到了离体细胞1 9 6 8年T a k e b e 等人首次报道，以果胶酶处理烟草叶细胞，从中获得大鼙具有代谢活性的叶肉细胞这种通过外植体切割、捣碎或酶解，所获得的单细胞数量较少，分散性好原始材料的选择是很重要的很多研究表明，不同的外植体在愈伤组织诱导及此后的细胞培养中表现出较人的差异( 童再康等，2 0 0 2 ；顾玉成等，2 0 0 4 ；焦海华，2 0 0 3 ) ，其中叶片是分离单细胞最好的材料经过愈伤组织诱导获得的愈伤组织是脱分化的薄壁细胞，转移到液体培养基中进行振荡培养，也可以获得游离的植物细胞。

董云洲( 1 9 9 8 ) 在丰抗8 号小麦悬浮细胞系的建立及遗传转化的初步研究中报道接种用M 9 ( M S + 2 m g ·L ”K C I + 0 ．5 9 ·L ．IN a c l + 1 0 0 m g ·L 以G l u t a m i n e+ 4 5 0 r a g ·L ”A s p a r a g i n e ) ，同时，将M S 中N H 4 N 0 3 和K N 0 3 的浓度均调到2g ·L ．‘，提高了氮素营养和盐离子浓度，起到了很好的筛选作只j ，可快速获得适合悬浮培养的细胞余舜武、朱永生( 2 0 0 1 ) 在快速建立胚性细胞悬浮系的培养程序初探中提出：为了缩短建立胚性悬浮细胞系的过程，快速获得松脆型愈伤组织，以普通小麦、黑麦和多花黑麦草为材料，采用能促进植株再生的高浓度铜离子为毒害筛选因子，不同梯度浓度的铜离子处理愈伤组织结果表明，O ．1t o o l ·L 的C u 2 + 对愈伤组织具有较好的筛选作用，能使松脆胚性愈伤组织保存下来，而其它类型愈伤组织褐化死亡，产生的松脆型愈伤组织能很快适应悬浮培养，从而快速建立胚性细胞悬浮系通过原生质体的再生也是获取植物细胞的一种方法，外植体、愈伤组织或是细胞团经过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞肇而获得原生质体，并在一定条件下培养，使之细胞壁再生，从而获得单细胞悬浮液。

自从1 9 6 0 年C o c k i n g 首次用酶法制备番茄根原生质体获得成功之后，植物原生质体的研究才逐渐变得活跃起来，经许多研究者的不断努力，已经建立起来了酶解法分离原生质体的基本程序，利用原生质体培养，融合，转化已经成为植物细胞改良创造作物新品种的新途径，并在改变植物遗传性的应用研究、基础研究中厂‘泛应用原生质体培养能否成功，在很大程度上取决于所用材料的种类由于木本植物愈伤组织7胞密度较低时能更有效地促进细胞克隆的形成和生长( 王蒂，2 0 0 4 ) 梅兴m ( 2 0 0 1 ) 等在采用紫外诱变紫杉醇高产细胞系时，采用了普通平板培养、条件培养和看护培养3 种培养方式；发现看护培养明显有利于单细胞克隆的生长，条件培养次之，平板培养较羞原因可能是看护培养除能提供植板细胞条件因子外，还可提供另一类不稳定的看护因子；这种冈子对细胞克隆的生长分裂具有很强的诱导作用，而在条件培养时，培养液中的这类因子有限，且可能已在制备过程中丢火1 ．2 ．3 ．3 影响体细胞培养的因素基因型和外植体种类是细胞培养的主要影响因子同一种植物的不同基因型在诱导愈伤组织和再生植株能力方面也有很大的差异，所诱导形成的愈伤组织性质也不尽相同。

因而在建立胚性细胞悬浮系就有不同的表现在软枣猕猴桃∽c t i n i d i aa r g u t a ) 悬浮细胞系建立及其影响因素研究时，发现愈伤组织的生长期对建立悬浮系有一定的影响，当取继代后生长1 4 d 以上的愈伤组织进行悬浮培养时，随着生长期的增加，褐化也越严重，褐化发生的时间越短，并且活细胞率也越低，畸形细胞增多( 张喜春等，1 9 9 1 ) 在龙眼【D i m o c a r p u sL o n g a nL o u r ．( E u p h o r i aL o n g a nL a m ．) 】悬浮植株再生的研究中，三种龙眼的各悬浮参数不同( 赖钟雄等，2 0 0 2 ) 植物生长调节剂的种类和浓度对于诱导和保持细胞悬浮系具有明显的作用其中2 ，4 ．D的浓度尤为重要，禾本科植物的细胞悬浮培养中，2 , 4 ．D 培养最有效( 邵宏波，1 9 9 0 ) 2 , 4 ．D的浓度过低会导致根的形成，造成悬浮培养物中含有不需要的根分生组织；而2 ，4 ．D 浓度过高，则不利于细胞悬浮培养物的生长，还会导致其胚性的迅速丧失( 安利佳，1 9 9 0 ；李风霞，1 9 9 3 ；K u m a r AS ，1 9 8 8 ) 。

张春喜等( 1 9 9 1 ) 报道，软枣称猴桃悬浮细胞系中当2 , 4 ．D 的浓度达到5m g ·L ．‘时，细胞的收获最仅为3m g ·一时的十二分之一水稻的悬浮培养中高浓度2 ，4 ．D 抑制细胞生长，不加2 ，4 ．D 的培养基可增加愈伤组织团块和积聚体的数量，但将其转移到分化8以防止细胞增大、液泡化和停止分裂糖类物质是植物组织和细胞培养中最常见的碳源和能源，同时有时维持细胞生长所需要渗透乐的渗透稳定7 N ( G a m b o r gOL ，e t ，1 9 8 1 ) 张进仁( 1 9 9 3 ) 在柑橘细胞悬浮培养中发现应用7 ．5 ％的蔗糖最终获得细胞数与其始细胞数的比率最大，细胞碎片最少，为最佳蔗糖浓度苜蓿悬浮细胞培养在3 ％．5 ％的蔗糖的液体培养基中生长最快，高于8 ％的生活生长缓慢( 张晓东，1 9 9 4 ) 小时杨悬浮培养细胞在3 ％- 5 ％的蔗糖的液体培养基中最有利于胚状体发生，高于8 ％则胚状体发生频率很低人们很早就认识到水解酪蛋白，酵母提取物，椰乳／麦芽糖提取物等有机附加物有利于离体培养的植物组织和细胞的生长，而且比加入单一的氨基酸更女．( - ( G a m b o r gOL ，e t ，1 9 8 1 ) 。

在建立禾本科植物胚性悬浮系的尝试中，人{ | ’J 对水解酪蛋白、酵母提取物、椰乳等的作用进行了研究，多数结果表明这些有机添加物可以促进胚性细胞悬浮培养物的生长、增殖，并可以提高其胚胎发生能力饵匿宏波，1 9 9 0 ) 悬浮培养物在适宜的浓度和合适的培养液下，能保持较好的分散状态当浓度过大时易巷出现聚堆、结块现象在培养基中加入2 , 4 ．D 、少量水解酶或加入酵母提取物液类物质，能够增加细胞的分散性尹庆良、刘世强( 1 9 9 4 ) 指出：在水稻悬浮体系建立的过程中，在液体培养基中附加．，6 0 0 m g ·L 4 的肌醇能够大大提高愈伤组织的分散程度分离单细胞的最佳时间应为继代后2 ～3 d 细胞悬浮系继代3 , - - 4 d 时，细胞数量的活细胞率都达最大值，此时是进行单细胞分离或原生质体游离的最佳时期贾景明、刘永昌等( 2 0 0 1 ) 在玉米单细胞培养的研究中指出：大量元素减半和0 ．5 ．1 ．0 m g ·L d 的2 , 4 ．D 浓度用于玉米单细胞培养，能获得良好的细胞分裂和生长，细胞悬浮培养获得了愈伤组织愈伤组织进行悬浮培养时，起始接种鼙很重要，培养密度过低，细胞生长缓慢，密度过高，易褐化且悬浮细胞易液泡化，细胞内含物变的透明、空洞。

悬浮培养的继代周期一般为7 d 李名扬等( 1 9 9 7 ) 认为细胞悬浮系7 d 继代一次即可保持培养物中有一定比例的、能正常分化和生长的细胞，有可保持并促进已形成得人细胞团的生长、分化以及原胚结构的形成植物细胞间的联系通常比微生物细胞的联系密切得多在细胞生长之前，在细胞内部必须建立起标准的内源水平在有高密度细胞群和培养墓营养丰富的情况F ，易于达到标准水平而在低密度下，由于细胞少，其向外渗透的代谢物总量少，很难提高培养基中的代谢物浓度，因而也就很难使细胞本身存留的代谢物达剑标准的内源水平，使细胞开始分裂( 颜昌敬等，1 9 9 0 ) 一般单细胞培养的起始密度越高，越容易诱导细胞的分裂，细胞植板率( 发生分裂的细胞占接种细胞的百分数) 增加随着起始密度减小，细胞植板率降低，同时细胞对培养基的要求也变的更加复杂在悬浮培养中，接种颦的多少对细胞生长往往有较大的影响( 颜昌敬等，1 9 9 0 ) 涂艺声、江洪如等( 1 9 9 4 ) 在草珊瑚细胞悬浮培养之研究中报道：在草珊瑚细胞悬浮培养过程中，起始培养的细胞浓度亦是影响细胞生长的一重要冈素悬浮培养的继代周期一般9东北农业人学农学硕士学位论文为7 d ，李名扬认为小悬浮系7 d 继代一次既可以保持悬浮培养物中有一定比例的、能正常分裂和生长的胚性细胞，有可保持并促进已形成的大细胞团的生长、分化以及原胚的形成。

1 ．2 ．3 ．4 体细胞植株再生体细胞植株再生有两种途径，即通过胚状体发育成植株或从愈伤组织诱导器官分化有的细胞悬浮系两种途径同时存在( 崔林等，1 9 9 7 ) 在液体培养基中进行细胞培养时，游离细胞可以生长和分裂成细胞团，称为胚性复合体，然后由胚性细胞复合体表面产生胚状体由于胚性细胞复合体原来可能是由一个单细胞分裂而来，然后再形成胚状体，因而仍可以认为它是单细胞起源，这种方式较为普遍，而游离单细胞直接发育成为胚状体则较少见( 周俊彦，1 9 8 2 ) 器官分化途径中，芽和根的形成主要取决于生长素和细胞分裂素两大类物质之间的相互调节作用，分裂素和生长素的比值高时有利于芽的分化，抑制根的形成( 张进仁等，1 9 9 3 ) 不同类型的细胞分裂索对不同的悬浮细胞系植株再生有不同的影响黑麦的细胞悬浮培养中，K T 和B A 抑制植株再生，z T 则显著促进悬浮系再生植株( 邢登辉等，1 9 9 5 ) 有些有机物如水解酪蛋白、麦芽提取物、谷氨酞胺对悬浮细胞再生植株有益( 路帖钢等，1 9 9 5 ) 悬浮系直接分化再生植株比原生质体再生植株相对容易，但也需要对悬浮细胞的状态进行必要的调控( 董云洲等，1 9 9 9 ) 。

根据王海波( 1 9 9 6 ) 的试验，悬浮细胞结果较长时间培养，细胞分散，颗粒细小，呈松软状，如果直接分化，将只能得到无序生长的愈伤组织，故必须将松软状愈伤组织改造成紧凑致密的块状或大颗粒机构1 ．2 ．3 ．5 植物体细胞培养的应用1 9 8 3 年日本人从培养的紫草细胞正式获得了紫草宁商品，成为第一个实现工业化生产成功的例子植物细胞的全能性的证实、高产量细胞的选择成功和合适的体外培养基的发展，使植物细胞离体培养成为可能，使其研究与开发工作迅速发展起来1 ．代谢产物的生产A e g n i n 和B o n n e r 在1 9 5 0 年首先进行了培养橡胶茎愈伤组织获取橡胶的尝试近5 0 年来，这一领域的研究取得了飞速的发展已经对4 0 0 植物进行过研究，从培养细胞中分离到6 0 0 多种次级代谢产物，主要集中在研究制药- 1 ：业中一些价格高、产餐低、需求量大的化合物上( 如紫杉醇、长春碱、紫草宁等) ，其次是油料( 如小豆蔻油、春黄菊油等) 、食品添加剂( 如生姜、洋葱、香子兰等) 、色素( 如番红花、姜黄等) 、调味剂( 胡椒、留兰香等) 、饮料( 咖啡、可可等) 、树胶( 如阿拉伯树胶等) 等。

2 ．细胞育种方面的应用一般认为植物组织或细胞离体培养过程中，通过器官发生再生植株能够稳定遗传外植体的基因型( 崔凯荣等，2 0 0 0 ) 这是植物进行组织细胞培养繁殖利保存优良品系的遗传基础然而，大量研究结果表明，再生植株的稳定性只是相对的，细胞染色体存在着广泛的变异，这些变异包括染色体倍性变异、非整倍体出现、染色体断裂、易位、缺失等特别是特定的物理条件下或是在添加2 ，4 ．D 等激素的培养及中，愈伤组织或是细胞培养的染色体变异现象更为普遍欧洲冷杉的胚性愈伤组织经3 a 继代后，细胞畸形，染色体数为三倍( 王仲英等，1 9 9 7 ) 细胞团或原生质体作为诱变对象是解决嵌合体的一条有效途径利用细胞悬浮培养与胁迫诱导处理、辐射诱变等相结合的方法能得到单细胞起源且遗传上稳定的突变体，提高抗性l O引言突变体的突变率和选择效率，如紫花苜蓿的抗盐植株、烟草抗氟苯丙氨酸后代的获得等菊花悬浮细胞培养及悬浮细胞辐射诱变选择耐低温突变体在国外已有零星报道( H u l t e m aJB M ，1 9 9 1 ：H u i t e m aJB M ，1 9 8 9 ；P r e i lW ，1 9 9 1 ) 。

张绮纹等( 1 9 9 5 ) 利用细胞悬浮培养技术成功的筛选出群众杨耐盐体细胞变异体的完整植株1 9 9 6 年曾慧( 1 9 9 6 ) 等就利用射线以及1 0 ％高蔗糖浓度作诱变剂和胁迫剂对甘蔗桂糖A 号进行诱变处理，筛选出甘蔗细胞突变新品系2 0 0 4 年张秀省等( 2 0 0 4 ) 用不同浓度的E M S 处理长春花愈伤组织，筛选出了生长较快且吲哚碱含量高的长春花突变细胞系同时，胚性愈伤组织或悬浮细胞还可以作为农杆菌侵染的植物受体，利用转基冈技术培养植株变异新品种如通过悬浮培养细胞或胚性愈伤组织与农杆菌共培养，得到的转基因植株有挪威云杉和火炬松、柑橘、甜樱桃、番木瓜、桃等3 ．用细胞培养进行植物无性系快速繁殖植株的再生可以通过3 种途径完成，胚培养、体细胞发生以及器官发生自从1 9 6 0 年M o r e l 报道了利用组织培养方法将兰花的茎尖剥离进行离体培养诱导再生成植株以来已有千种的植物能进行离体培养再生植株，其中包括水稻、玉米、番茄、马铃薯、甘蔗、草莓、兰花、香蕉、葡萄、苹果等能够达到快速繁殖的有数百种，能够进行规模化和商业化生产的近百种其中马铃薯的无性系快速繁殖，既解决了种薯脱毒，又达到了快速繁殖无毒种苗《的目的。

但这种用组织培养方法达到的快速繁殖，需要成百或成千上万个容器米生产大批量的植株这一过程劳动强度大、费用昂贵而通过悬浮培养植物细胞进行快速无性系繁殖被认为是一个有前途的开发途径这种方法所用植物材料要少得多，劳动强度大大下降，具有较大的经济性1 ．2 ．4 存在的问题近年来对现代月季离体培养的研究取得较人进展，但是仍存在如下问题：；( 1 ) 对高效再生基因型的筛选工作较少目前在花卉、蔬菜和作物等植物再生体系研究中，已经开始重视对不同基冈型植物再生能力的比较和对具有高效再生潜力基冈犁的筛选，并且候选基冈型较多多数可达到十个以上而对木本植物再生研究中，往往忽视了基因型的筛选，或是被选基因型较少，只能筛选出一个或几个高效再生的基因型其主要原因在于木本植物外植体生理特性复杂，组织培养和再生体系建立均比较困难，再生周期较长，各个基因型再生效率差异较大，增加候选基因型的数量，势必会增加研究的难度和工作最这限制了转化受体系统建立后期，对抗生素和农杆菌敏感的现代月季基因型的进一步筛选 2 ) 再生体系重复性差目前多数月季类型已经建立了高效离体再生体系，但研究多侧重于月季再生体系的建立和应用由于木本植物结构和功能存在高度复杂性，对影响离体再生的因素、因素间的交互作用和各冈素对再生能力的影响机制等方面研究不够深入：对影响月季再生体系稳定性的根本原冈尚不明确，导致了月季再生效率不稳定、试验重复性差、随机性大，尤其经农杆菌侵染和抗生素抑菌后，再生效率明显降低，这严重的制约了月季遗传转化效率的提高。

3 ) 再生途径单一东北农业大学农学硕十学位论文与草本植物相比，木本植物组织培养体系和再生体系建立比较困难常规方法是通过器官和愈伤组织途径建立再生体系而悬浮细胞、原生质体、体细胞胚胎发生途径由于影响因素较多，建立再生体系难度大通过器官和愈伤组织途径再生出的不定芽，可能存在多细胞起源问题，在转基因过程中容易出现嵌合体现象；而单细胞起源的悬浮细胞系、原生质体和体细胞胚胎发生途径在转基因过程中，更有利于得到高质母的转化植株因此，有必要通过改变再生途径来避免转基冈植株嵌合体现象的出现1 ．3 研究内容与技术路线本研究分为3 个部分；( 1 ) 以5 个优良现代月季品种为试验材料，以一年生嫩茎为外植体，建立无菌培养快速繁殖体系，讨论最佳的增殖培养基和生根培养基，并获得大量无菌苗：( 2 ) 选择无菌培养表现优良的无菌苗，建立叶片和幼茎离体再生体系通过调节再生培养基中植物生长调节剂的种类、组合及浓度，筛选不同现代月季基因型最佳叶片和幼茎愈伤组织诱导培养基，并调节愈伤组织状态，使其成为胚性愈伤组织，在此基础上，优化培养条件促进愈伤组织的再分化，建立植株再生体系；( 3 ) 选取愈伤组织表现好的基因型，建立现代月季悬浮细胞培养体系，观察悬浮体系细胞生长状态。

讨论培养方法、植物生长调节剂对现代月季细胞悬浮培养的影响，并通过条件培养方法诱导现代月季悬浮细胞再生植株，为以悬浮细胞为材料的现代月季育种：r ：作提供技术基础鉴予以往木本植物离体再生培养和细胞悬浮培养研究经验，本研究技术路线如图1 - 1 所示1 2引言图1 - l 现代月季愈伤组织再生与细胞培养研究技术路线F i g ．1 - 1T h et e c h n i q u er o u t eo fs t u d yo nc a l l u sr e g e n e r a t i o na n dc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r eo fm o d e mr o s e s1 3东北农业大学农学硕十学位论文2 材料与方法2 ．1 材料2 ．1 ．1 植物材料选用东北农业火学园艺学院提供的5 个现代月季( R o s ah y b r i d a ) 种：‘2 0 0 4 ．1 ’号、‘2 0 0 4 ．2 ’号‘2 0 0 4 ．6 ’号、‘2 0 0 4 ．8 ’号和‘2 0 0 4 ．9 ’号( 以后分别简称为月季晶种1 号、2 号、6 号、8 号、9 号) 。

种植于东北农业大学香坊试验实习基地和东北农业大学园林植物与观赏同艺实验室保护地，采用露地和大棚栽种2 ．1 ．2 主要试验仪器高压灭菌锅( H V E ．5 0 ，日本)双人单面超净工作台( Z H J H ．1 l1 2 ，上海)标准型p H 计( P B ．2 0 ，北京)加热磁力搅拌器( R C Tb a s i c ，广州)电热恒温培养箱( D H 5 0 0 0 A B ，天津)M o t i c 系列显微镜( 双筒数码可拍照显微镜、倒置显微镜、体视显微镜，日本)人工气候培养箱( H P G ．2 8 0 H 智能，哈尔滨)恒温振荡培养箱( H Z Q ．X 1 0 0 ，天津)电子分析天平( A W 2 2 0 ，香港)血球计数板( X B ．K ．2 5 ，上海)2 ．1 ．3 培养基和培养条件2 ．1 ．3 ．1 基本培养基基本培养基：M S 培养基，碳源为蔗糖，7 ．5 9 ·L - l 琼脂固化：生根培养采用I ／2 M S 培养基( 无机盐含量减、辟) ；悬浮培养采用液体M S 培养基( 不添加固化剂) 培养基在灭菌前p H 值调整为5 ．8 ，配制分装后于1 2 1 ℃，1 ．5 个大气压下，灭菌2 0 m i n 。

2 ．1 ．3 ．2 培养条件本研究中的组织培养条件，除指明是暗培养的其它均为光照培养暗培养在D H 5 0 0 0A B型电热恒温培养箱内进行光照培养在智能型人工气候培养箱内进行0 0 点- - 0 5 点光照0 级温度( 2 5 士2 ) ℃湿度5 0 ％0 5 点- - 0 8 点光照2 级温度( 2 5 士2 ) ℃湿度6 0 ％0 8 点一1 5 点光照4 级温度( 2 5 士2 ) ℃湿度7 0 ％1 5 点一1 8 点光照3 级温度( 2 5 圭2 ) ℃湿度6 0 ％1 8 点- 2 2 点光照2 级温度( 2 5 士2 ) ℃湿度5 0 ％2 2 点- 0 0 点光照O 级温度( 2 5 士2 ) ℃湿度5 0 ％1 4养基混合均匀，高压灭菌后使用2 ．2 方法2 ．2 ．1 现代月季快速繁殖体系的建立2 ．2 ．1 ．1 材料表面消毒处理接种材料为5 个月季品种当年抽生侧芽饱满的幼嫩茎段，将外植体加入洗衣粉浸泡l Om i n 并用流水洗净，用自来水冲洗3 0m i n ；于超净工作台上用7 5 ％乙醇浸泡3 0 s ，3 ％N a C l 0表面消毒“7m i n 。

消毒后的外植体用无菌蒸馏水冲洗5 次，用无菌滤纸吸干多余的水分2 ．2 ．1 ．2 丛生芽的诱导将经过消毒处理的茎段切成l ～2 c m 的小段，接种在丛生芽诱导培养基中为了研究植物激素对丛生芽诱导的影响，试验选取6 - B A 和N A A 两种激素，通过不同的激素配比进行激素的筛选，见表2 ．1 培养温度为2 5 C ，每天光照1 0 一1 2h 、光照强度1 5 0 0 ～20 0 0L x 的条件下培养表2 ．1 丛生芽诱导培养基的设计T a b ．2 —1T h ed e s i g no fs h o o t sc u l t u r eM e d i u m ( r a g - L 1 )2 ．2 ．1 ．3 生根壮苗与移栽将诱导获得的健壮无根的幼苗接种到不同的培养基中进行生根培养，生根培养基如下：( 1 ) 1 ／2 M S ；( 2 ) 1 ／2 M S + N A A 0 ．0 5m g ·L ”；( 3 ) 1 ／2 M S + N A A 0 ．1m g ·L ．1 ；( 4 ) 1 ／2 M S +N A A 0 ．2 m g ·L 一；( 5 ) 1 ／2 M S + N A A 0 ．5m g ·L ．1 。

培养温度为2 5 C ，每天光照l O - 1 2h 、光照强度1 5 0 0 ．20 0 0L x 选取生根壮苗培养后苗高约1 0 ．1 5 c m 的幼苗在散射光条件下培养4 ．5 d ，将封1 2 1 膜打开培养2 - 3 d ，将苗取出并洗净根部培养基，移栽入灭菌的士壤与细沙分层的混合基质中，植后浇一次透水，注意遮阴保湿，温度保持在2 5 ．3 0 ℃，相对湿度在8 0 ％左右根系开始生长后，东北农业人学农学硕十学位论文每周定期喷洒I ／2 M S 大量元素营养液生根诱导后3 0d 后统计生根情况，生根率( ％) = 生根外植体数／存活外植体总数x1 0 0 2 ．2 ．2 愈伤组织的诱导2 ．2 ．2 ．1 叶片及幼茎愈伤组织的诱导分别取5 个月季品种无菌苗的小叶和幼茎为外植体，将小叶切割成0 ．5 c m 2 左右的小块，幼茎切割成2 ．3 c m 长的小段，接种到愈伤组织诱导培养基中，基本培养基为M S ，添加不同的生长调节剂，见表2 ．2 ，附／J n 3 ％的蔗糖与0 ．7 ％的琼脂，P H 值调至为5 ．8 愈伤组织诱导过程首先在黑暗条件r 卜．进行，待外植体开始诱导愈伤组织后再放在光照条件下进行培养。

每个处理均采用1 0 0 个外植体，培养3 0 d 后开始观察愈伤组织诱导情况，愈伤组织诱导率( ％) = 产生愈伤组织外植体数／接种外植体数×1 0 0 ，试验数据先用E X C E L 初步处理，再用D P S进行统计分析表2 ．2 愈伤组织诱导试验设计T a b ．2 - 2D e s i g no f e x p e r i m e n to f c a l l u si n d u c t i o n2 ．2 ．2 ．2 愈伤组织的继代培养诱导出的愈伤组织培养3 0 d 后培养基的养分和水分都不充分，需要将愈伤组织进行继代培养继代时剔除死去和生长不好的组织，将细胞生长旺盛的组织切成约1 ．0 c m 2 左右的小块接种在与原来培养基成分相同的新的配养基中，直至愈伤组织结构和形态趋于稳定1 6材料’j 方法12 ．2 ．2 ．3 愈伤组织状态的显微观察将不同状态的愈伤组织放在M o t i c 体视显微镜下观察愈伤组织的表面形态，并照相记录将不同状态的愈伤组织用F A A 同定液固定2 4 h ，7 0 ％乙醇冲洗，经过一系列的脱水、透明和渗蜡，石蜡包埋等程序，进行常规石蜡切片观察。

切片厚度8 ．1 0 1 x m ，番红固绿染色，中性树胶封固，在N i k o n5 0 i 光学显微镜下进行观察并照相记录2 ．2 ．3 愈伤组织分化培养将能够在继代培养基中正常生长的愈伤组织切成1 ．0 c m 2 左右的小块，接种到愈伤组织分化培养基中，其基本培养基为M S 和1 ／2 M S ，分化培养基的激素组成采用4 因素3 水平的正交试验设计方案，见表2 ．3 ，附加3 ％的蔗糖与O ．7 ％的琼脂，P H 值调至为5 ．8 培养条件为黑暗条件和光照培养进行对照，培养3 0 天后观察并统计愈伤组织分化情况表2 ．3 愈伤组织分化培养基激素组成的正交研究方案T a b ．2 - 3T h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t sd e s i g na n dr e s u l t so fh o r m o n ec o m p o s i t i o n so nc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n2 ．2 ．4 细胞悬浮系的建立2 ．2 ．4 ．1 细胞悬浮系的启动取5 个月季品种的愈伤组织2 ．O g ，刚镊子挟碎后接种在与愈伤组织继代培养基成分相同( 仅去掉琼脂) 的液体培养基中，每1 0 0 m l 的三角瓶中加入液体培养基3 0 m l ，整个培养过程在黑暗条件进行，摇床转速为1 0 0 ．11 0 r ／r a i n ，培养温度2 5 ±2 ℃。

2 ．2 ．4 ．2 细胞悬浮系的继代细胞悬浮系在培养1 5 d 后进行继代培养继代时将培养物静置5 r a i n 后，用吸管吸出小1 7东北农业大学农学硕：L 学位论文细胞团和培养液于刻度试管中，弃去大的细胞团，静止2 0 m i n ，用吸管吸出上面大部分的原有培养基，只留下约5 m l 的原有培养基，用滴管加入新鲜培养基凋整至3 0 m l ，把细胞液移至1 0 0 m l 三角瓶中，重新进行振荡培养定期在倒置显微镜下观察悬浮细胞生长情况，当悬浮颗粒变得小而均匀时进行下一步试验2 ．2 ．4 ．3 细胞悬浮系生长特性的测定及测定方法在最适的培养条件下，每个月季品种选择l O 瓶细胞悬浮液，接种后每2 d 取样一次，分别测量悬浮培养基的p H 值，取平均值；每2 d 取各月季品种悬浮液3 瓶，用5 ％铬酸对细胞悬液进行处理，使其分散均匀，用血球计数板统计细胞生长状况，取平均值并绘制曲线：细胞密度( 个·m L 以) = 5 个区细胞总数X1 0 0 0 0 ：接种后每2 d 取3 瓶，进行密实细胞体积( P C V ) 、鲜重、干重测定，取平均值细胞密实体积( P V C ) N 定( 李浚明，2 0 0 2 ) ：培养一定时间的悬浮细胞，取均匀分散的悬浮液8 m i ，转入1 0 m l 带有刻度离心管中，2 0 0 0 r p m 下离心5 m i n ，测得每毫升培养液中细胞总体积的毫升数，即细胞密实体积，并将测量后的细胞重新放回三角瓶中振荡培养。

每个处理重复3 次注意若细胞边际线还不够清晰，则必须增加离心时间离心之后必须立即读取读数几个重复应该同时进行，然后求其平均值鲜重( F w ) 的测定( 李浚明，2 0 0 2 ) ：将悬浮细胞倒在下面架有漏斗己知重量的湿尼龙网上，H j 水洗去培养基，用滤纸吸去细胞上沾着的多余水分，再刚精密分析天平称重，即可求得细胞鲜重每个处理重复三次干重( D w ) 的测定( 李浚明，2 0 0 2 ) ：用己知重量的干尼龙网依上法收集悬浮细胞，在6 0 ℃下干燥1 2 h 后称重每个处理重复三次2 ．2 ．5 细胞悬浮系的再生从稳定的细胞悬浮系中分别吸取体积为2 ．0 m l 的悬浮细胞液分别转移到固体和液体愈伤组织诱导培养基中进行培养，基本培养基为M S ，培养基的激素组成见表2 ．5 ，培养条件为黑暗条件和光照培养进行对照待愈伤长到直径0 ．8 e r a 左右时，将愈伤组织接种到成熟分化培养基上诱导再生植株，成熟分化培养基的激素组成参照叶片和幼茎愈伤组织分化培养基的组成成分1 8材料’j 方法表2 ．5 愈伤组织诱导试验设计T a b ．2 - 5D e s i g no fe x p e r i m e n to fc a l l u si n d u c t i o n植物生长调- l I 了剂处理Plantg r o w t hr e g u l a t o rT r e a t m e n t s6 - B A ( m g ．L - t ) 2 ．4 ．( m g ．L " 1 ) N A A ( ．- 1 )(．LmgUDm g LAm g LK Tm g L - 1 ))2 ．4 ．)(’1 )(’1 )l0000200 ．20 ．20 ．1301 ．O1 ．00 ．540 ．100 ．20 ．55．0 ．10 ．21 ．0060 ．11 ．000 ．170 。

5O1 ．00 ．180 ．5O ．200 ．590 ．51 ．00 ．201 9东北农业大学农学硕十学位论文3 结果与分析3 ．1 月季快速繁殖体系的建立3 ．1 ．1 丛生芽诱导结果将5 个现代月季品种的幼嫩茎段接种到丛生芽诱导培养基上一周后，腋芽开始萌动膨大( 见图3 ．1 中A ) ，两周后芽陆续萌发，平均每个外植体可以萌发1 ．2 个芽( 见图3 ．1 中B ) 待腋芽萌发后，将小芽切下接种到新鲜的培养基上进行继代培养，幼芽迅速生长增殖( 见图3 - 1 中C ) ，在继代两次后统计不同培养基上芽增殖率( 继代后总茁数／第一次接种外植体数) ，见表3 ．1 表3 ．1 不同培养基对5 个月季品种腋芽增殖率的影响T a b ．3 - 1E f f e c t so f d i f f e r e n tm e d i u m sO i lt h er a t eo f s h o o t sm u l t i p l i c a t i o no f f i v em o d e r nr o s e s基冈型编号6 - B AN A AG e n o t y p eN o ．( m g ．L - I ) ( m g ’L - 1 )l 号2 号6 号8 号9 号1O ．50 ．0 50 ．2 2 - - + 0 ．0 5 fO ．2 8 - + 0 ．0 5 hO ．124 - 0 ．0 5 hO ．2 0 ±0 ．0 3 9O ．2 34 - 0 ．0 4 h21 ．00 ．0 51 ．0 4 ±0 ．1 2 d e1 ．5 5 ±0 ．1 0 e1 ．6 6 ±0 ．0 8 e2 ．1 0 ±0 ．1 3 d1 ．2 3 ±0 ．0 4 f32 ．00 ．0 52 ．8 5 ±0 ．1 4 b3 ．6 8 ±0 ．0 5 a4 ．0 7 ±0 ．0 7 a4 ．2 0 ±0 ．1 l a3 ．8 4 ±O ．0 2 b42 ．50 ．0 54 ．2 0 ±0 ．1 2 a3 ．2 6 ±0 ．0 8 b3 ．7 l ±0 ．0 3 b3 ．9 4 ±0 ．0 2 b3 ．5 7 ±0 ．0 4 c52 ．00 ．12 ．8 0 ±0 ．1 5 b2 ．9 1 ±0 ．0 5 c3 ．0 8 ±0 ．0 9 c3 ．0 2 ±0 ．0 8 c3 ．9 9 ±0 ．0 7 a62 ．00 ．52 ．0 9 ±0 ．1 7 c1 ．9 2 ±0 ．1 3 d2 ．5 5 ±0 ．1 l d2 ．2 l ±0 ．0 5 d3 ．0 5 ±0 ．1 1 d72 ．01 ．01 ．2 0 ±0 ．1 2 d1 ．3 3 ±0 ．0 7 f1 ．4 6 ±0 ．0 7 f1 ．2 3 ±0 ．1 2 e1 ．3 6 ±0 ．0 8 e82 ．02 ．0O ．9 3 ±O ．1 0 eO ．5 4 + 0 ．0 8 90 ．9 2 4 - 0 ．0 9 9O ．6 9 ±O ．0 8 f1 ．0 6 4 - 0 ．0 8 9注：3 次重复，每个处理3 0 个外植体N o t e ：T h r e er e p e a t s ，3 0e x p l a n t se v e r yt r e a t m e n t由上表可以看出不同的基因型在丛生芽的增殖过程对激素的敏感度存在着一些差异，但品种间的差异并不明显，而且各品种在适宜的培养基上的增殖率基本上都能达到4 ．0 ，这说明研究所选择的丛生芽诱导增殖培养基能适合多种现代月季基因型的快速繁殖。

其中，适合l号月季品种丛生芽萌发和增殖的培养基为：M S + 6 ．B A 2 ．5 m g ·L ～+ N A A 0 ．0 5 m g ．L 一，增殖率能达到4 ．2 ；适合2 号、6 号和8 号月季品种丛生芽萌发和增殖的培养基为：M S + 6 ．B A 2 ．O m g ·L d+ N A A 0 ．0 5 m g ·L ．1 ，增殖率分别能达到3 ．6 8 、4 ．0 7 和4 ．2 ；适合9 号月季品种丛生芽萌发和增殖的培养基为：M S + 6 ．B A 2 ．0 m g ·L ．1 + N A A 0 ．1m g ·L - 1 ，增殖率可达到3 ．9 9 研究中发现，当利用低浓度的N A A ( O ．0 5 r a g ·L d ) 时，随着6 ．B A 浓度的增加，腋芽的萌发率2 0殖率都不断降低，而且会诱导产生愈伤组织( 见图3 ．1 中D ) 因此，研究认为较高浓度的细胞分裂素会促进丰花月季腋芽的萌发，而较高浓度的生长索会抑制腋芽的萌发而促进愈伤组织的形成3 ．1 ．2 组培苗生根诱导与移栽将继代增殖的5 个月季无菌苗转入到生根培养基上，3 0 d 后统计生根情况见表3 ．2 ，可以看出在I ／2 M S + N A A 0 ．0 5m g ·L 4 和I ／2 M S + N A A 0 ．Im g ·L 4 的生根培养基上5 个月季品种无菌苗生根率及生根的数目均较高，且根较粗壮( 见图3 ．1 中E ) 。

试验表明，低浓度的生长素有利根的形成，适当浓度的N A A 对生根率有显著影响，浓度过高会抑制根的形成，选择0 ．0 5 ．0 ．1m g ·L ’1 的生长素浓度能够有效地促进根的形成，加速苗的生长将生根后的组培苗开瓶在散射光下炼苗四至五天后，移栽至经过灭菌的1 ／2 蛭石、1 ／2 营养土的双层基质上驯化( 见图3 ．1 中F ) ，最后定植在露地中，移栽成活率都可达8 8 ％以上表3 —25 个现代月季品种在不同培养基上的生根培养结果T a b ．3 - 2T h er e s u l to fr o o t i n go ff i v em o d e r nr o s e so nd i f f e r e n tc u l t u r em d i u m s注：3 次重复，每个处理3 0 块外植体N o t e ：T h r e er e p e a t s ，3 0e x p l a n t se v e r yt r e a t m e n t2 l东北农业人学农学硕十学位论文拿! ! ! 鼍! ! ! ! 喜毫苎! 皇曼! ! ! 曼詈皇巴曼詈詈! 詈詈詈鼍鼍i ! ————i i 暑! 皇鼍皇詈! 鼍! ! 曼皇詈皇曼皇曼皇詈皇詈鲁曼詈! 曼皇詈詈詈皇! 毫≯曹’，A ’爹。

已一，置瓮～A ”≯渺锡，} 悠《Jh ～毫∥一』、”? ￡；{ 场≈BE图3 ．1 现代月季快速繁殖体系的建立F i g ．3 一lM i c r o p r o p a g a t i o no f4c u l t i v a r so fF l o r i b u n d ar o s e注：A ．腋芽萌动膨大( 8 号品种) ；B ．腋芽开始增殖( 8 号品种) ；C ．从生势快速繁殖( 9 号品种) ；D ．诱导中产生的愈伤纽织( 1 号品种) ；E ．试管苗的生根培养( 8 号品种) ；F ．无菌苗炼苗驯化( 8 号品种)N o t e ：A ．S w e l l i n ga n dg e r m i n a t i n go fa x i l l a r yb u d s ( C u l t i v a r8 ) ；B ．A x i l l a r yb u d sb e g a nm u s h r o o m ( C u l t i v a r8 ) ；C ．A x i l l a r yb u d sr a p i d l yp r o p a g a t e d ( C u i t i v a r9 ) ：DT h ec a l l u sf o r m e di np r o c e s so fc u l t u r e ( C u l t i v a r1 ) ；E ．T h er o o t i n gc u l t u r eo fa s e p t i cs e e d l i n g s ( C u l t i v a r8 ) ；F ．T h ed o m e s t i c a t i o na n dt r a n s p l a n t i n go fa s e p t i cs e e d l i n g s( C u l t i v a r8 )3 ．2 现代月季愈伤组织的诱导3 ．2 ．1 叶片愈伤组织的诱导将5 个现代月季品种无菌苗的叶片接种到愈伤诱导培养基上，培养7 ．1 2 d 后，愈伤组织开始在切口处、边缘及中脉处形成，2 0 ．2 5 d 后，愈伤组织大量增殖，培养3 0 d 后，培养基内营养物质和水分消耗殆尽，将愈伤组织转接到新的培养基上进行继代培养，愈伤组织的状态逐渐趋于稳定( 见图3 ．2 ) 。

叶片愈伤组织诱导结果如表3 ．3 所示，5 个品种的现代月季在附加不同的生长调节剂的培养基中均可诱导出愈伤组织，在适宜的培养基上，各品种叶片愈伤组织的诱导率均可达到9 0 ％以上根据愈伤组织的诱导率及愈伤组织继代培养的能力，确定5 个月季品种叶片愈伤组织诱导的最佳培养基l 号、8 号月季品种叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D 3 ．0m g ·L 一，诱导率均可达到1 0 0 ．0 0 ％；2 号、6 号、9 号月季品种叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D 2 ．0m g ·L ．J + 6 ．B A 0 ．5m g ·L ．‘，诱导率分别可达到9 7 ．6 7 ％、9 8 ．6 7 ％、1O O ．O O ％M S + 2 ．4 ．D O ．52 0 ．6 7 ±3 ．5 1 f2 7 ．6 7 ±6 ．0 3 i2 6 ．0 0 ±4 ．5 8 i3 9 ．0 0 ±2 ．O O e3 6 ．0 0 ±6 ．5 6 e fM S + 2 ．4 一D 2 ．08 5 ．0 0 ±5 ．5 7 b8 8 ．3 3 ±3 ．7 9 b e9 5 ．6 7 4 - 1 ．5 3 a8 5 ．0 0 4 - 5 ．5 7 b c9 5 ．3 3 4 - 5 ．0 3 aM S + 2 ．4 ．D 3 ．01 0 0 ．0 0 4 - 0 ．0 0 a9 7 ．0 0 4 - 3 ．0 0 a b9 3 ．6 7 4 - 4 ．0 4 a b1 0 0 ．0 0 4 - 0 ．0 0 a1 0 0 ．0 0 ±0 ．0 0 aM S + 2 ．4 ．D 5 ．09 5 ．3 3 4 - 4 ．1 6 a9 2 ．6 7 4 - 3 ．7 9 a b8 6 ．3 3 4 - 4 ．7 3 b c8 3 ．0 4 - 6 ．2 5 b c8 6 ．3 3 4 - 4 ．7 3 bM S + N A A 0 ．55 2 ．3 34 - 4 ．5 1 d4 5 ．6 7 4 - 3 ．2 1 h4 5 ．0 0 4 - 3 ．0 0 93 6 ．0 0 ±6 ．0 0 e2 7 ．6 7 4 - 7 ．2 3 f gM S + N A A 2 ．06 7 ．3 3 ±6 ．5 1 c7 3 ．0 0 4 - 4 ．5 8 d e6 3 ．0 0 4 - 5 ．5 7 d e6 4 ．3 3 4 - 6 ．6 6 d4 0 ．0 0 ±3 ．0 0 eM S + N A A 3 ．06 4 ．0 0 4 - 4 ．3 6 c8 0 ．3 3 4 - 7 ．5 7 c d5 5 ．3 3 4 - 5 ．6 9 e f5 5 ．3 3 4 - 7 ．2 3 d5 5 ．0 0 ±7 ．5 5 dM S + N A A 5 ．04 6 ．6 7 4 - 5 ．1 3 d5 8 ．6 7 4 - 8 ．6 2 f g3 3 ．6 7 4 - 6 ．6 6 h i4 1 ．0 0 ±4 ．0 0 e5 5 ．3 3 4 - 7 ．3 7 dM S + 2 , 4 - D 2 ．08 ；．3 3 ．．6 7 ±3 ．2 1．6 7 4 - 1 ．5 39 3 ．0 0 i6 ．2 5 a b100．04-0．004-56 9 b9 7a9 85 3 a9 36a b1 0 00 00 0 a8 5 ．3 3．．6 7 ±3 ．2 1．6 7．．．．．M S + 2 ，4 ．D 2 ．01 0’7 1 ．0 0 4 - 3 ．6 l C7 9 ．6 7 ±7 ．2 3 c d+ 6 ．B A l ．OM S + 2 ．4 - D 2 ．01 1’3 4 ．0 0 4 - 8 ．1 9 e5 8 ．3 3 4 - 5 ．5 1 9+ 6 ．B A 2 ．08 3 ．6 7 4 - 5 ．8 6 c7 5 ．3 34 - 6 ．6 6 c8 2 ．0 0 4 - 4 ．5 8 b6 7 ．O O ±5 ．5 7 d3 5 ．0 0 ±6 ．5 6 e f7 1 ．6 7 ±4 ．0 4 c1 2M 8 竺A 2 ～7 0 ．3 3 4 - 8 ．5 06 7 ．6 7 + 6 ．0 3f5 0 ．3 3 4 - 4 ．0 4 f g6 3 ．0 0 4 - 8 ．5 4 d．004-4．36704 - 85 0 c6 760 3 e f5 03 3 4 - 44 - 85 4 d4 20 043 6 e●●●●●●●●●●+ 6 ．B A 0 ．51 3M s + N A A 2 —4 9 ．0 0 4 - 7 ．0 0 d．4 - ．1 l3 6 ．6 7 4 - 6 ．1 l h4 1 ．0 0 + 7 ．5 53 4 ．3 34-7．09ef433 3 4 - 6h3 66 7 4 - 6h475 5 e3 43 370 9 e f．．1 1．．．．．．+ 6 - B A I ．U1 4M s + N A A 2 ～1 9 ．6 7 4 - 3 ．0 6 f⋯：·5 ．5 7 i1 2 ．0 0 4 - 4 ．5 8 12 5 ．3 3 ：8 ．22．04-4．58220 055 71 20 0 4 - 45 8 j2 53 3 4 - 86 2 f2 20 45 8 9．‘i．．．．．．+ 6 - B A 2 ．0注：3 次重复，每个处理1 0 0 块外植体N o t e ：T h r e er e p e a t s ，10 0e x p l a n t se v e r yt r e a t m e n tl23456789东北农业大学农学硕一卜学位论文r 销—粥4 一_ —? 哕譬■黟r ≯■黟1稳。

，÷鞔j | ．鬃誉’| 2 ， ，一』：、、、妒：? 篓≥：_ j _ ；? 蓍；，，”冬．”-：|||骜一囊茹《∥”一9 惫，茎；’{ 一二7 ‘蠢≯’_ i7、_ ：忒菇i 、霉注：A ．叶片接种于愈伤组织诱导培养基中( 1 号品种) ；B ．叶片愈伤组织的形成( i 号品种) ；C ．叶片愈伤组织继代时的状态( 1 号品种)N o t e ：A ．L e a v e sw a sc u l t u r e do nt h ec a l l u si n d u c e m e n tm e d i u m ( C u l t i v a r1 ) ；B ．T h ef o r m a t i o no fl e a v e sc a l l u s( C u l t i v a r1 ) ；C ．T h ec h a r a c t e r i s t i c so fl e a v e sc a l l u sO i lt h es u b c u l t u r em e d i u m ( C u l t i v a r1 )3 ．2 ．1 ．1 不同基因型问叶片愈伤组织诱导能力的差异将5 个现代月季品种的叶片在相同的愈伤组织诱导培养基M S + 2 ，4 ．D 2 ．0m g ·L - I + 6 ．B A 0 ．5m g ·L q 上的培养结果进行比较，表3 ．4 的结果表明，在相同培养基上，9 号月季品种叶片愈伤组织诱导率最高，可达到1 0 0 ．0 0 ％；1 号月季晶种叶片愈伤组织诱导率最低，诱导率为8 4 ．0 0 ％。

经方差分析可知( 见表3 —5 ) ，在相同的愈伤组织诱导培养基上，2 号、6 号、8 号和9 号月季品种间叶片愈伤组织诱导率不存在极显著筹异，l 号品种与2 号、6 号和9 号间存在极显著差异，与8 号品种间不存在极显著差异由此可见，本研究选择的5 个月季品种叶片愈伤组织的诱导能力虽然有一些著异，但是差异并不是很明显，这表明本研究选抒的愈伤组织诱导培养基适合多种月季基因型的叶片愈伤组织的诱导表3 - 45 个月季品种叶片愈伤组织诱导能力差异T a b ．3 - 4T h ed i f f e r e n c e so fl e a v e sc a l l u si n d u c e m e n ta b i l i t ya m o n gf i v er o s ec u l t i v a r s品种内2 0 3 ．3 3 3 3总变异7 0 1 ．3 3 3 31 02 0 ．3 3 3 31 43 ．2 ．1 ．2 激素对现代月季叶片愈伤组织诱导的影晌激素的种类及浓度对现代月季叶片愈伤组织的诱导具有重要的影响，本研究探讨了不同的生长素种类N A A 和2 ，4 ．D 及与不同浓度的6 - B A 组合使用时对现代月季叶片愈伤组织诱导的影响。

研究表明，5 个品种的现代月季叶片在附加一定浓度的生长素N A A 或2 ，4 ．D 均能得到愈伤组织，但无论从诱导率还是从所诱导愈伤的状态上看，2 , 4 ．D 诱导愈伤组织的效果要好于N A A ，而且由N A A 诱导出的愈伤组织在继代过程中褐化严重，而由2 ，4 ．D 诱导出的愈伤组织在进一步的继代过程中表现良好，适合进行下一步的实验( 见图3 ．3 中A ，B ) 当生长素与细胞分裂素配合使用时，2 ，4 ．D 与6 - B A 的配合诱导效果也要好于N A A 与6 ．B A ，当细胞分裂素的浓度较低时，有时一些品种( 2 号、6 号、9 号) 会形成质量较高的愈伤组织，在继代过程中表现良好，适合进行下一步的培养，( 见图3 ．3 中C ) ，但当细胞分裂素浓度达到一定的浓度时，愈伤组织的诱导率和生长量均下降，愈伤组织的结构也非常的致密( 见图3 ．3中D ) ，在继代过程不断褐化死亡，这说明较高浓度的细胞分裂素不适宜用于月季叶片愈伤组织的诱导i李．；，，；t }鬟主图3 ．3 激素对现代月季叶片愈伤组织的影响F i g ．3 —3T h ee f f e c to fh o r m o n eo nl e a v e sc a l l u s2 5东北农业人学农学硕士学位论文注：A ．附加2 , 4 ．D 诱导出的愈伤组织( 8 号品种) ；B ．附加N A A 诱导出的愈伤组织( 8 号品种) ；C ．2 , 4 ．D与6 - B A 组合使用时诱导的质量较高的愈伤组织( 8 号品种) ；D ．2 ，4 ．D 与6 - B A 组合使用时诱导的结构致密的愈伤组织( 8 号品种)N o t e ：A ．T h ec a l l u si n d u c e db yt h em e d i u ma d d i n g2 ，4 ·D ( C u l t i v a r8 ) ；B ．T h ec a l l u si n d u c e db yt h em e d i u ma d d i n gN A A ( C u l t i v a r8 ) ；C ．T h ec a l l u sw i t hh i g h e rq u a l i t yi n d u c e db yt h em e d i u ma d d i n g2 , 4 - Da n d6 - B A( C u l t i v a r8 ) ；DT h ec a l l u sw i t hc o m p a c tt e x t u r ei n d u c e db yt h em e d i u ma d d i n g2 ，4 - Da n d6 - B A ( C u l t i v a r8 )3 ．2 ．2 幼茎愈伤组织的诱导表3 - 6 不同培养基对5 个月季品种幼茎愈伤组织诱导率的影响T a b ．3 - 6E f f e c t so f d i f f e r e n tm e d i u m so ny o u n gs t e m sc a l l u si n d u c t i o no f f i v er o s ec u l t i v a r s注：3 次重复，每个处理1 0 0 块外植体N o t e ：T h r e er e p e a t s ，10 0e x p l a n t se v e r yt r e a t m e t l t结果’i 分析! _ ．I I I●I III|。

皇曼曼皇曼曼曼曼皇寰将5 个现代月季品种幼嫩茎段在愈伤诱导培养基上培养1 5 ．2 0 天后，愈伤组织在切口处逐渐形成愈伤组织，愈伤组织经过继代培养逐渐趋于稳定( 见图3 ．4 ) ，各品种的诱导结果如表3 - 6 所示根据愈伤组织的诱导率及愈伤组织继代培养的能力，确定5 个月季品种幼茎愈伤组织诱导的最佳培养基I 号、6 号月季品种幼茎诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D 3 ．0m g ·L 一，诱导率分别可达到7 8 ．6 7 ％，8 4 ．3 3 ％；2 号月季品种幼茎诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D 2 ．0m g ·L ．I ，诱导率可达到7 3 ．6 7 ％：8 号、9 号月季品种幼茎诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 - D 2 ．0 m g ·L 1 + 6 ．B A 0 ．5 m g ·L ．’，诱导率分别为8 2 ．3 3 ％、8 0 ．3 3 ％∥黟嬲甓黟燃形一甲”‘貉，∥9 ，荔一铆黟⋯∥”伊爹啊? 鼍爹，| ；旗一}’|、一雾荔i7 ∥’雾，毒：j7 ，舶乏Ii ．{》o 譬“㈡- ，∥‘，雪”◆；i彰-，t i 、‘、。

戮，?霪毳珈么缀乏乏戡磊二耘锄磊；：! 纛乏瓣螽磊，，幺彩+ j ，；，；B 一；鏊皇童：弘毒；：兹；易籀≤簇F i g ．3 - 4T h ep r o c e s so f y o u n gs t e m si n d u c i n gc a l l u so fm o d e mr o s e s注：A ．幼茎接种于愈伤组织诱导培养基中( I 号品种) ：B ．幼茎愈伤组织的形成( I 号品种) ；C ．幼茎愈伤组织继代时的状态( I 号品种)N o t e ：A ．Y o u n gs t e m sw a sc u l t u r e do nt h ec a l l u si n d u c e m e n tm e d i u m ( C u l t i v a r1 ) ；B ．T h ef o r m a t i o no fy o u n gs t e m sc a l l u s ( C u l t i v a rI ) ；C ．T h ec h a r a c t e r i s t i c so f y o u n gs t e m sc a l l u s0 1 1t h es u b c u l t u r em e d i u m ( C u l t i v a r1 )3 ．2 ．2 ．1 不同基因型问幼茎愈伤组织诱导能力的差异将5 个现代月季品种的幼茎在相同的愈伤组织诱导培养基M S + 2 ．4 ．D 2 ．0m g ·L ．‘+ 6 ．B A 0 ．5m g ·L ．‘上的培养结果进行比较，表3 ．7 的结果表明，在相同培养基上，8 号月季品种幼茎愈伤组织诱导率最高，可达到8 2 ．3 3 ％；1 号和2 号月季品种幼茎愈伤组织诱导率最低，诱导率均为6 7 ．3 3 ％。

经方差分析可知( 见表3 ．8 ) 在相同的愈伤组织诱导培养基上，6 号、8 号和9号月季品种间幼茎愈伤组织诱导率不存在极显著差异，l 号、2 号和6 号品种间不存在极显著差异，l 号、2 号与8 号和9 号品种问存在极显著差异由此可见，本研究选择的5 个月季品种幼茎愈伤组织的诱导能力虽然有一些著异，但是差异也不是很明显，这表明本研究选择的愈伤组织诱导培养基也适合多种月季基因型的幼茎愈伤组织的诱导2 7东北农业人学农学硕上学位论文表3 ．75 个月季品种幼茎愈伤组织诱导能力差异T a b ．3 - 7T h ed i f f e r e n c e so fy o u n gs t e m sc a l l u si n d u c e m e n ta b i l i t ya m o n gf i v er o s ec u l t i v a r s表3 ．8 方差分析表T a b ．3 - 8T h et a b l eo f v a r i a n c ea n a l y s i s3 ．2 ．2 ．2 激素对现代月季幼茎愈伤组织诱导的影响激素的种类及浓度对现代月季幼茎愈伤组织的诱导同样具有重要的影响，本研究探讨了不同的生长素种类N A A 和2 ，4 一D 及与不同浓度的6 - B A 组合使刚时对现代月季幼茎愈伤组织诱导的影响。

研究表明，5 个品种的现代月季幼茎在附加一定浓度的生长素N A A 或2 , 4 ．D 均能得到愈伤组织，但从诱导率与诱导愈伤的状态上看，2 4 ．D 诱导愈伤组织的效果要明显强于N A A ，N A A 诱导出的愈伤组织结构较松软，在继代过程中更加松软，不适合进行下一步的分化研究( 见图3 ．5 中A 、B ) 当生长素与细胞分裂素组合使用时，2 , 4 ．D 与6 - B A 的配合诱导效果较好固定生长素浓度时，较低浓度的细胞分裂素能够促进形成质量较高的愈伤组织( 见图3 ．5 中C ) ，但当细胞分裂素浓度逐渐升高时，愈伤组织的诱导率和生长量均下降，愈伤组织的结构也非常的致密，在继代过稃褐化严重( 见图3 ．5 中D ) ，这与叶片诱导愈伤组织的反应相同锄：懿老参女彩燃l 篪，《i 缓巍一≯一氇：、7 锈㈡锄％镳图3 ．5 激素对现代月季幼茎愈伤组织的影响F i g ．3 —5T h ee f f e c to fh o n n o n eO i ly o u n gs t e m sc a l l u s注：A ．附加2 , 4 ．D 诱导出的愈伤组织( 8 { ，品种) ；B ．附加N A A 诱导f J ：的愈伤组织( 8 号品种) ；C ．2 ，4 ·D与6 - B A 组合使用时诱导的质量较高的愈伤组织( 8 号品种) ；D ．2 ，4 ．D 与6 - B A 组合使用时诱导的质量较差的愈伤组织( 8 号品种)N o t e ：八T h ec a l l u si n d u c e db yt h em e d i u ma d d i n g2 ，4 ·D ( c u l t i v a r8 ) ：B ．T h ec a l l u si n d u c e db yt h em e d i u ma d d i n gN A A ( c u l t i v a r8 ) ；C ．T h ec a l l u sw i t hh i g h e rq u a l i t yi n d u c e db yt h em e d i u ma d d i n g2 ，4 一Da n d6 - B A ( c u l t i v a r8 ) ；DT h ec a l l u sw i t hp o o rq u a l i t yi n d u c e db yt h em e d i u ma d d i n g2 , 4 - Da n d6 - B A ( c u l t i v a r8 )3 ．2 ．3 愈伤组织的显微观察在5 个现代月季品种叶片和茎段愈伤组织诱导和继代的过程中，能够在继代过程中继续增殖的愈伤组织大致可以分为三类：I 类致密愈伤，乳白色或淡绿色( 见图3 - 6 中A ) ；I I 类松软湿泥状愈伤( 见图3 - 6 中B ) ，向色或灰白色，松软湿润；l I l 类松脆的愈伤，绿色或黄绿色( 见图3 - 6 中C ) 。

用体视显微镜观察其表面特征( 见图3 - 6 中D 、E 、F ) ，并使用石蜡切片的方法观察其细胞特征I 类愈伤组织表面较光滑，细胞大多为圆形，少数为不规则的长形，排列紧密，细胞核不明显，生长缓慢( 见图3 - 6 中G ) I I 类愈伤组织表面细颗粒状，细胞体积膨犬，多液泡化，多由长而大的细胞组成，细胞排列疏松I l I 类愈伤组织表面有很多圆形的突起，组织多由小而密的细胞组成，细胞体积小，多为等径的圆形，细胞壁薄，细胞核大，细胞质浓，生长速度快( 见图3 - 6 中1 ) 2 9A _ C ¨；o }．氛，连■，纭∥≯；，，：I'，￡瓤磐；，毫积吖擘，一，、|．．，誊一一，}||承够、，0，曹，，～冁，麓锄；争；；∥；；缝笏∥弘》?配彩翳翳貔驴≯拟—貔东北农业人学农学硕上学位论文图3 ．6 不同状态的愈伤组织及显微观察F i g ．3 - 6T h em i c r o s c o p i co b s e r v a t i o no fd i f i e r e n tc a l l u s注：A ．1 类愈伤组织；B ．I I 类愈伤组织：C ．1 I I 类愈伤组织；D ．体视显微镜下I 类愈伤组织；E ．体视显微镜下I I 类愈伤组织；F ．体视姓微镜下I I I 类愈伤组织；Gl 类愈伤组织石蜡切片( x 4 0 0 ) ：H ．I I 类愈伤组织石蜡切片( ×4 0 0 ) ；I ．I I l 类愈伤组织石蜡切片( ×4 0 0 )N o t e ：A ．T h ek i n dIo fc a l l u s ；BT h ek i n dI Io fc a l l u s ；C ．T h ek i n dI IJo fc a l l u s ；D ．T h ek i n d1o fc a l l u su n d e rs t e r e o m i c r o s c o p e ；E ．T h ek i n dI Io fc a l l u su n d e rs t e r e o m i c r o s c o p c ；ET h ek i n dI I Io fc a l l u su n d e rs t e r e o m i c r o s c o p e ；QT h ep a r a f f i ns e c t i o no ft h ek i n dIo fc a l l u s ( x4 0 0 ) ；H ．T h ep a r a f f i ns e c t i o no ft h ek i n dI Io fc a l l u s ( ×4 0 0 ) ；I ．T h ep a r a f f i ns e c t i o no f t h ek i n dl I Io f c a l l u s ( X4 0 0 )3 ．3 现代月季愈伤组织的分化将5 个现代月季品种愈伤组织接种在分化培养基上，培养3 0 d 后，愈伤组织开始发生分化，各品种愈伤组织分化的结果如表3 - 9 所示。

结果与分析表3 - 9 各月季品种愈伤组织分化情况T a b ．3 ．9C a l l u sd i f i e r e n t i a t i o no fd i f f e r e n tr o s ec u l t i v a r s愈伤组织米源C a ll u sS o u r c e s培养基( m g ·L ’1 )M e d i u m愈伤组织分化途径分化率( ％)C a l l u sd i f f e r e n t i a t i o nw a yR a t e注：3 次重复，每个处理5 0 块外植体N o t e ：T h r e er e p e a t s ，5 0e x p l a n t se v e r yt r e a t m e n t在月季愈伤组织分化培养过程中，5 个月季品种的愈伤组织均发生再分化，除2 号月季品种未获得再生植株外，其他4 个品种均获得再生植株，但各品种分化率和分化途径都有很大的差异其中，适合l 号品种叶片愈伤组织分化的培养基为M S + 2 ，4 一D O ．2m g ·L ．‘+ T D Z 9 ．0m g ·L “+ G A 3 0 ．1m g ·L ．1 ，分化途径为器官发生途径( 见图3 ．7 中A ) ，愈伤组织直接分化出不定芽，分化率达到1 8 ．0 0 ％，适合幼茎愈伤组织分化的培养基为M S + 6 - B A 0 ．5m g ·L ．。

2 ，4 ·D O ．2m g ·L - l + T D Z 8 ．0m g ·L ．1 + G A 3 0 ．5m g ·L - I ，愈伤组织在培养过程中形成具有胚性的愈伤组织，( 见图3 ．7 中B ) ，但形成的胚性愈伤组织再进一步的培养过程中朱发生分化：适合2 号品种叶片和幼茎愈伤组织分化的培养基分别为M S + 2 ，4 ．D O ．2m g ·L 一+ T D Z 9 ．0m g ·L 一+ G A 3 0 ．1m g ·L 一、M S + 6 ．B A 0 ．5m g ·L - l + 2 ，4 ．D I ．0m g ·L 一+ T D Z 9 ．0m g ·L ．1 ，分化过程都只能到胚性愈伤，未进一步形成不定芽或胚状体；适合6 号品种叶片愈伤组织分化的培养基为M S + 6 - B A 0 ．1m g ·L “+ 2 ，4 ．D I ．0m g ·L ．1 + T D Z 8 ．0m g ·L ～+ G A 3 0 ．1m g ·L ～，分化途径为器官发生途径，愈伤组织直接分化出不定芽，分化率达到2 2 ．o o ％( 见图3 ．7 中C ) ，适合幼茎愈伤组织分化的培养基为M S + 6 ．B A 0 ．5m g ·L ～+ T D Z l 0 ．0m g ·L ～+ G A 3 0 ．1m g ·L ．1 ，愈伤组织在培养过程中形成具有胚性的愈伤组织；适合8 号品种叶片愈伤组织分化的培养基为1 ／2 M S + 6 ．B A 0 ．5m g ·L - ‘+ T D Z l 0 ．0m g ·L 一+ G A 3 0 ．1m g ·L - 1 、M S + 2 ，4 ．D O ．2m g ·L ”+ T D Z 9 ．0m g ·L - 1 + G A 3 0 ．1m g ·L ．1 ，前者愈伤组织分化途径为胚状体途径，胚状体通过继代培养可形成再生植株，分化率为1 8 ．6 7 ％，后者分化途径为不定芽途径，愈伤组织直接分化出不定芽，分化率达到2 1 ．3 3 ％，适合8 号品种幼茎愈伤组织分化的培养基为M S + T D Z 8 ．0m g ·L ～，分化途径为器官发生途径，愈伤组织直接分化出不定芽，分化率可达到4 6 ．6 7 ％( 见图3 ．7 中D 、E 、F 、G ) ；适合9 号品种叶片愈伤组织分化的培养基为M S + 6 ．B A 0 ．1m g ·L ～+ T D Z 9 ．0m g ·L ．‘+ G A 3 0 ．5m g ·L - I ，分化途径为不定芽途径，分东北农业大学农学硕十学位论文化率达到1 6 ．6 7 ％，适合9 号品种幼茎愈伤组织分化的培养基为M S + 2 ．4 ．D O ．2m g ·L ～+ T D Z 9 ．0m g ·L 一+ G A 3 0 ．1m g ·L 一，分化途径为胚状体途径，分化率为3 5 ．3 3 ％( 见图3 ．7 中H 、I 、J ) 。

r 毪一厂—? ：琴鬻鬻9§％o + ‘一+⋯h ，；《o ，≤+ 耘? ：≮臻，k：％≯鬈l 靠z ％‰蠢叶；÷《| k “! 罐i 瓤疵i 赫j妙’!～：擎≯、结童o ，≤螽：鼍√“7 孥囊捌i ，萋耘i o k ：缸动链，潼图3 ．7 各月季占J 1 种愈伤组织分化结果F i g ．3 - 7T h er e s u l t so fc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o no fd i f f e r e n tm o d e mr o s ec u l t i v a r s注：A ．1 号品种叶片愈伤组织分化不定芽；B ．胚性愈伤组织( I { ．} 品种) ：C ．6 号品种叶片愈伤组织分3 2≮淞一．矿噱，．I：F≯教％F《曩念∥-≮≮，峻“争≤鼍吼2*，j~、十☆掣筠}，8 ：H ．T h ea d v e n t i t i o u sb u d sd i f f e r e n t i a t e db yl e a v e sc a l l u so fc u l t i v a r9 ；1 ．T h es o m a t i ce m b r y od i f f e r e n t i a t e db yy o u n gs t e m sc a l l u so f c u l t i v a r9 ：J ．T h es o m a t i ce m b r y of o r m e da d v e n t i t i o u sb u do f c u l t i v a r93 ．3 ．1 胚性愈伤组织的形成过程在月季愈伤组织分化过程中，胚性愈伤组织的形成是愈伤组织能否发生分化的前提，因此弄清胚性愈伤组织形成机理，对调控矛¨提高愈伤组织的分化具有重要重要的意义。

本研究取愈伤组织分化培养过程中不同时期的愈伤组织进行石蜡切片显微观察，分析愈伤组织形成胚性过程组织细胞的变化规律，试验结果如图3 ．7 所示图3 ．8 胚性愈伤组织形成过程F i g ．3 - 8T h ef o r m a t i o np r o c e s so fe m b r y o g e n i cc a l l u s注：A ．愈伤组织的初始状态( ×4 0 0 ) ；B ．排列整齐的愈伤组织( ×4 0 0 ) ；c ．愈伤组织细胞开始分化( ×4 0 0 ) ；D ．愈伤组织形成分生组织( X4 0 0 ) ：E ．愈伤组织开始形成胚( X4 0 0 )3 3C东北农业人学农学硕{ ：学位论文IN o t e ：A ．T h ei n i t i a ls t a t eo fc a l l u s ( ×4 0 0 ) ；B ．T h em a r s h a l l i n gc a l l u s ( ×4 0 0 ) ；C ．C a l l u sc e l l sb e g a nt od i f f e r e n t i a t e ( ×4 0 0 ) ；D ．C a l l u sf o r m e dg e n e r a t i n gt i s s u e ( X4 0 0 ) ；E ．C a l l u sb e g a nt of o r me m b r y o ( x4 0 0 )接种时，愈伤组织的细胞排列没有规则，细胞性状也有大有小( 见图3 ．7 中A ) ，经过一周左右的培养后，细胞排列趋于整齐，细胞大小趋于一致，细胞性状呈近圆形，经过1 5 d 左右的培养后，愈伤组织开始发生分化，细胞排列变得不整齐，其中的一些细胞分裂速度快，细胞排列更紧密，一些细胞分裂速度慢，细胞排列较疏松，经过2 0 d 后，这些分裂速度快的细胞区域开始形成分生组织( 见图3 ．7 中C 、D ) ，培养3 0 d 后，分生区域开始形成胚( 见图3 - 7 中E ) ，愈伤组织开始形成不定芽或者胚状体，但愈伤组织分化不定芽与分化胚状体的变化机理还不清楚，还需要经过更深入的研究。

3 ．3 ．2 基因型和外植体对愈伤组织分化的影响在月季愈伤组织分化培养过程中，在相同的愈伤组织分化培养基上，各品种愈伤组织分化能力和分化途径都有很大的差异，叶片和幼苹的愈伤组织分化也存在很大的差异，其中，2号品种愈伤组织朱能形成再生植株，l 号、6 号、8 号和9 号品种叶片愈伤组织均可以分化不定芽，l 号和6 号品种幼苇愈伤组织术能形成不定芽芽或者胚状体，8 号品种幼茎愈伤组织可以分化不定芽，叶片愈伤组织可以分化出胚状体，9 号品种幼茎愈伤组织可分化出胚状体，而且各分化培养基的成分均不一样，这表明各品种愈伤组织分化对激素的敏感度都不相同，这与愈伤组织诱导时对激素的反应存在很人的差异根据研究统计分析发现，各品种幼茎愈伤组织的分化能力都强于叶片愈伤组织，比如，8 号品种幼苇愈伤组织分化不定芽的分化率可达4 6 ．6 7 ％，而叶片愈伤组织分化不定芽的分化率仅为2 1 ．3 3 ％，这表明进行愈伤组织分化培养时宜选择月季幼茎为外植体3 ．3 ．3 培养基及激素对愈伤组织分化的影响本研究发现，在诱导各月季品种愈伤组织的培养基中，经继代培养未发生愈伤组织分化，由此表明单独附加生长素类物质N A A 、2 , 4 ．D 或与细胞分裂素6 ．B A 组合使用时均不能使愈伤组织发生分化。

在愈伤组织分化培养基中选择了较高浓度的T D Z 与不同浓度的2 ，4 ．D 、6 - B A 、G A 3 组合使用，结果均可使五个月季品种愈伤组织发生分化，其中8 号品种与9 号品种获得了再生植株，这说明T D Z 在月季愈伤组织分化培养过程中具有重要的作用试验过程中发现，单独使用T D Z 时，仅仅只有品种8 号幼茎愈伤组织发生分化，其他的分化还需要几种激素组合使用，各激素效应的曲线如图3 - 9 所示激素的种类与浓度与基因型和外植体紧密相关本研究发现，在使用I ／2 M S 基本培养基时，只有8 号品种叶片愈伤组织能够分化出胚状体，其他牖种愈伤组织均为发生分化，这表明1 ／2 M S 培养基能够诱导月季愈伤组织分化，但激素的浓度可能需要进行调整，具体的调整方法还需要进行进一步的研究，本研究中适宜的分化基本培养基为M S 图3 - 9 激素效应曲线图F i g ．3 - 9T h eh o r m o n e ·e f f e c tg r a p h3 ．3 ．4 光照条件对愈伤组织分化的影响本研究发现，各品种愈伤组织发生分化均是在光照培养条件下产生的，各月季品种在黑暗条件下愈伤组织均未能发生分化。

黑暗条件下愈伤组织在分化培养中可以继续生长，但愈伤组织的颜色呈白色或者灰白色，分化能力差或不具分化能力( 见图3 ．1 0 中A ) ，光照条件下的愈伤组织呈绿色或者黄绿色，对其进行切片观察可看出这种愈伤组织的细胞中含有大量的叶绿素( 见图3 ．1 0 中B 、C ) ，这种形态的愈伤组织在继代培养过程中形成胚性，在进一步的培养过程中可诱导出胚状体或不定芽，据此可以推测适宜的光照条件可促使愈伤组织细胞产生叶绿素，而只有这种含有叶绿素的愈伤组织细胞才能够进行进一步的分化3 5东北农业人学农学硕士学位论文；+，≯，蠡舯一“彰’辅} 7 鑫? ％+ 7‘一琵么；纭；貔锄；；镒貂≤；；酝；；貂；图3 ．1 0 光照条什对愈伤组织的影响F i g ．3 - 1 0T h ee f f e c to f l i g h tc o n d i t i o n so nc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n注：A ．黑暗条件下愈伤组织的形态；B ．光照条件下愈伤组织的形态；C ．光照条件下愈伤组织细胞内含有大量的叶绿素( ×6 0 0 )N o t e ：A ．T h ea p p e a r a n c eo fc a l l u su n d e rd a r kc u l t u r e ；B ．T h ea p p e a r a n c eo fc a l l u su n d e rl i g h tc u l t u r e ；C ．T h ec e l l so f c a l l u sc o n t a i nal o to f c h l o r o p h y l lu n d e rl i g h tc u l t u r er ×6 0 0 )3 ．3 ．5 愈伤组织状态对愈伤组织分化的影响上文捉到，在月季愈伤组织的诱导和继代过程中，山现了3 种类型的愈伤组织，将3 种类型的愈伤组织分别接种在分化培养基中观察分化情况，结果发现，只有Ⅲ类愈伤组织能够在分化培养基中逐渐形成胚性( 见图3 ．1 l 中A ) ，并发生分化，J 类和I I 类愈伤组织都不具备分化能力，I 类愈伤组织在分化培养基中愈伤组织迅速增殖，经3 0 d 培养后，体积约为原来体积的5 - 6 倍，愈伤组织多为淡绿色，表面白色绒毛状( 见图3 ．1l 中B ) ，I I 类愈伤组织在分化培养基中增殖速度更快，经3 0 d 培养后，体积可达原米体积的1 0 倍，愈伤组织多为暗黄色，质地变得更加松散，表面颗粒状( 见图3 ．1 l 中C ) 。

这表明，不同的愈伤组织分化能力有很大的差异，愈伤组织分化培养过程中适宜选择I I I 类愈伤组织作为外植体≤j ◆：n 譬’_ ，_ ■∥，；：霉17 ，’9 一：“一，一謦．1 |一，i ；‘≮濡_ ：；、，，7 ，，一：焉≯，9 舞I ，“二镰黪l I 誓．i 一} ^ 果’j 分析注：A ．I I I 类愈伤组织在分化培养过程中初始表现；B ．I 类愈伤组织在分化培养过程中的状态；C ．I I 类愈伤组织在分化培养过程中的状态N o t e ：A ．T h ei n i t i a la p p e a r a n c eo ft h ek i n d1 1 1o fc a l l u su n d e rd i f f e r e n t i a t i o nc u l t u r e ；B ．T h ea p p e a r a n c eo ft h ek i n dIo f c a l l u su n d e rd i f f e r e n t i a t i o nc u l t u r e ；C ．T h ea p p e a r a n c eo ft h ek i n dI Io f c a l l u su n d e rd i f f e r e n t i a t i o nc u l t u r e3 ．3 ．6 继代次数对愈伤组织分化的影响对各月季品种来分化的愈伤组织进行不断的继代培养，随着继代次数的不断增加，愈伤组织的分化能力逐渐下降，愈伤组织的颜色和形态也不断恶化，其中胚性愈伤组织在继代过程中表面逐渐变黄，分化能力不断下降，胚性消失( 见图3 ．1 2 中A ) ，I 类愈伤组织在继代过程中产生水滴状的透明分泌物，且愈伤组织结构变得更加致密( 见图3 ．1 2 中B ) 。

I l 类愈伤组织在继代过程中退化成淡红色，结构变得更加疏松( 见图3 ．1 2 中C ) 当继代次数大于5 次之后，多数愈伤组织就基本丧失增殖能力，大量的褐化死亡( 见图3 ．1 2 中D ) ，这表明，在进行愈伤组织分化培养时，继代次数应不超过5 次，超过5 次后的愈伤组织需要及时淘汰，若需要进一步试验，须重新诱导愈伤组织∥鬻譬嘴；㈣彩参， ，’菇铊霎ii ；0 ≥罐⋯融鼯』拳 罐≯图3 ．1 2 继代对愈伤组织分化的影响F i g ．3 ．1 2T h ee f f e c to fs u b c u l t u r et i m e so nc a l l u sd i f f e r e n t i m i o n注：A ．胚性愈伤组织经多次继代后退化：B ．I 类愈伤组织继代过程中产生水滴状分泌物；C ．1 I 类愈伤组织继代过程中退化成淡红色：D ．丧失增殖能力的愈伤组织N o t e ：A ．T h ee m b r y o g e n i cc a l l u sd e g r a d a t e da f t e rs u b c u l t u r eo nm a n yo c c a s i o n s ；B ．T h ed r o p - s h a p e ds e c r e t i o n sp r o d u c e df r o mt h ek i n dlo fc a l l u s ：C ．T h ek i n d1 1o fc a l l u sd e g e n e r a t ei n t ol i g h tp i n k ；D ．T h ec a l l u sw i t h o u tm u l t i p l i c a t i o nc a p a c i t y3 7图3 ．1 3 细胞悬浮系的启动过科F i g ．3 ·1 3T h ep r o c e s so f i n i t i a lc u l t u r eo f c e l ls u s p e n s i o n注：A ．细胞悬浮系初始培养：B ．初始悬浮细胞状态( ×4 0 0 ) ：C ．稳定的悬浮细胞系：D ．稳定的悬浮细胞3 83 ．4 ．2 细胞悬浮培养过程中P H 值的变化规律细胞悬浮液的P H 对体细胞的生长具有重要的影响。

本研究通过分析细胞悬浮培养过程中P H 的变化规律，研究悬浮液中体细胞的生长特性5 个品种P H 的变化如图3 ．1 4 所示，5个月季品种细胞悬浮培养过程中P H 值的变化趋势基本一致，这表明在细胞悬浮培养过程中5 个月季品种体细胞的生长特性大体一致，P H 值随着培养时间不断降低，分析原因可能是在细胞培养过程中，细胞对营养物质具有选择性吸收，从而调控特定基因的表达，同时细胞生长过程中释放的代谢物质使培养液中离子浓度不断发生变化，从而影响P H 值的变化，因此，P H 值的改变在某种程度上反映了营养元素的消耗程度和代谢产物在培养介质中的积累程度从图中可以看出，在细胞培养的前8 d ，P H 值的变化明显，这表明在细胞悬浮培养一周时间里，体细胞的新陈代谢较明显，培养1 0 d 后，P H 值变化趋势减缓，这表明体细胞的生长趋于稳定，酸性的培养条件和产生的次生代谢物质使细胞的生长受到抑制i65 ．55羞4 ．543 ．53o ”‘7 ”’嘶≯彬”⋯一’? ’? j ’“弘? ””‘≯’⋯“j # ”4 鬻K ≮妊7 {≮、≮物叫除吲，，It “●l 一、I心“t，O2481 01 21 41 6培养天辑( d )图3 ．1 45 个月季品种细胞悬浮培养P H 变化曲线F i g ．3 - 14P Hv a r i a t i o no fs u s p e n s i o nc u l t u r eo ff i v em o d e mr o s ec u l t i v a r s3 ．4 ．3 细胞悬浮系的生长特性由于在细胞悬浮培养过程中，5 个月季品种的生长特性基本一致，因此以1 号品种和8号品种为例，细胞恳浮细胞系的生长特性的测定结果见图3 ．1 5 、图3 ．1 6 和图3 ．1 7 。

从图中可以看出，细胞悬浮细胞系的生长变化是近似“S ”形曲线，在培养～周左右的时间里，悬浮液中的细胞数目、细胞的密实体积( P C V ) 、鲜重( F w ) 和干重( D W ) 增长量表现出高度同步性说明细胞分裂和细胞内物质积累处于协调一致发展过程中细胞系的活跃生长期在培养后的第4 ．8 d ，此期间细胞数目、体积、鲜重和干重呈指数迅速增长，细胞表现出强烈的分裂能力3 9东北农业人学农学硕十学位论文第4 d 时细胞P C V 、鲜重和干重均约增加l 倍约8 d 后，悬浮细胞的P C V 和鲜重增加约4倍，干重增加都约3 ．5 倍约l O d 后增长停I 七，培养1 2 天后悬浮细胞系中细胞数目、细胞干重和鲜重还有所下降出现这种现象可能是由于随着培养时间的延长，细胞分裂使营养成分不断消耗，培养液中营养成分逐渐变得缺乏，从而使细胞内含物的积累减少，细胞干重和鲜重下降同时可能一些产生一些有毒代谢产物不断积累也限制了细胞的持续生长因此，月季悬浮细胞培养周期过长不利于建立稳定悬浮细胞系，过短则操作麻烦且细胞生长量不足，8 - l O 大继代一次比较适宜悬浮系培养后4 ．8 天内的细胞生长旺盛，活性强，适宜用来进行细胞系的再生培养。

423×叮2籁型1器O圜l3579l l1 31 51 7培养天数( d )图3 ．1 5 悬浮系细胞数目变化曲线F i g ．3 - 15T h ev a r i a t i o nc u r v eo fs u s p e n s i o nc e l l sn u m b e r s矗l1 0型9掣8：654321O+ P C V “1 )_ - 鲥重( g )’‘干重( g )O2{681 01 21 41 61 8培养时『H I ( d )图3 ．1 6l 号品种悬浮系生长曲线F i g ．3 —16T h eg r o w t hc u r v eo fc e l ls u s p e n s i o n so fc u l t i v a r1O24681 01 21 41 61 8培莽时悯( d >图3 ．1 78 号品种悬浮系生长曲线F i g ．3 —17T h eg r o w t hc u r v eo fc e l ls u s p e n s i o n so fc u l t i v a r83 ．5 细胞悬浮系的再生培养3 ．5 ．1 悬浮细胞愈伤组织的诱导将5 个现代月季品种培养6 d 的悬浮细胞分别接种在吲体和液体愈伤诱导培养基上，在尉体培养基上培养约3 0 后，体细胞开始逐渐形成愈伤组织，4 0 ．5 0 d 后，固体培养基上形成大量的愈伤组织团( 见图3 ．1 8 中A 、B ) ，在液体培养基中培养约1 0 d ，体细胞开始形成较大的细胞团，继代培养2 次后，开始形成愈伤组织( 见图3 ．1 8 中C 、D ) ，各品种的诱导结果如表3 ．1 0 所示。

表3 ．1 0 各月季品种悬浮细胞愈伤组织诱导情况T a b ．3 一10C a l l u si n d u c e m e n to fc e l ls u s p e n s i o n sd i f f e r e n tr o s ec u l t i v a r s注：3 次重复，每个处理5 0 瓶培养基N o t e ：T h r e er e p e a t s ，5 0e x p l a n t se v e r yt r e a t m e n t由上表可以看出，5 个月季品种中只有l 号、8 号和9 号的细胞悬浮液能够诱导出愈伤组织，2 号和6 号品种未能诱导出愈伤各品种细胞悬浮系诱导愈伤组织的能力都很低，其中l 号品种悬浮细胞在固体培养基M S + 6 ．B A 0 ．1m g ·L - l + 2 ，4 ．D 1 ．0m g ·L ．1 + K T 0 ．1m g ·L 4 愈伤4 l东北农业人学农学硕卜学位论文g , mn 一．n 詈詈! ! 曼! ! 曼! 曼皇皇鼍詈喜詈詈! 詈暑曼詈曼皇! 詈鼍! ! ! ! 曼曼! ! ! 詈曼曼! 鼍! 暑! 詈曼! 曼詈鼍组织诱导率仅为2 2 ．0 0 ％，悬浮细胞在液体培养基M S + 6 一B A 0 ．5m g ·L ．1 + 2 ，4 一D O ．2m g ·L - I + K T 0 ．5m g ·L - 。

愈伤组织诱导率为5 ．3 3 ％；8 号品种悬浮细胞在固体培养基M S + 2 ，4 一D 1 ．0m g ·L ‘1+ N A A l ．0m g ·L 一+ K T 0 ．5m g ·L ．1 愈伤组织诱导率为2 7 ．3 3 ％，在液体培养基中未得到愈伤组织；9 号品种悬浮细胞在【司体培养基M S + 2 ，4 - D I ．0m g ·L 一+ N A A l ．0m g ·L 一+ K T 0 ．5m g ·L 4 愈伤组织诱导率为2 6 ．6 7 ％，悬浮细胞在液体培养基M S + 6 ．B A 0 ．5m g ·L q + 2 ，4 ．D 1 ．0m g ·L 一+ N A A 0 ．2m g ·L 4 愈伤组织诱导率仅为2 ．6 7 ％罗爹爹移甏移图3 ．1 8 细胞悬浮系愈伤组织诱导结果F i g ．3 - 18T h er e s u l t so f c a l l u si n d u c e m e n to f c e l ls u s p e n s i o n s注：A 周体培养基中悬浮细胞开始形成愈伤组织；B ．同体培养娃中悬浮细胞形成的愈伤组织团；C ．液体培养基中体细胞分类形成细胞团( ×2 0 0 ) ；D ．液体培养基中悬浮细胞诱导的愈伤纽织N o t e ：A ．S u s p e n s i o nc e l l sb e g a nt of o r mc a l l u sO Ns o l i dm e d i u m ；B ．T h ec a l l u si n d u c e db ys u s p e n s i o nc e l l so ns o l i dm e d i u m ；C ．S o m a t i cc e l ls p l i t t i n gf o r m i n gc e l l si nl i q u i dm e d i u m ( x 2 0 0 ) ；DT h ec a l l u si n d u c e db ys u s p e n s i o nc e l l si nl i q u i dm e d i u m3 ．5 ．1 ．1 叶片、幼茎愈伤组织诱导能力与悬浮细胞之间的差异通过比较5 个品种叶片、幼茎与悬浮细胞愈伤组织的诱导结果发现( 见图3 ．1 9 ) ，5 个月季品种叶片和幼茎都具有很强的愈伤组织诱导能力，但悬浮细胞的愈伤组织诱导能力大大降低，2 号品种与6 号品种悬浮细胞在试验中愈伤组织诱导率为0 ，造成这个现象可能的原因包括：培养基的选择，本试验悬浮细胞愈伤组织诱导基本培养基只选择了M S ，具有很大的局4 2磊絮。

一} p十+f，§}t，*月，j-?j；：》长调节物质有可能有助于悬浮细胞形成愈伤组织试验中还发现，悬浮细胞诱导愈伤组织的时间远远长于叶片和幼茎，叶片和幼茎经过1 5 ．2 0 d 就可以形成大量的愈伤组织，而悬浮细胞需要人约5 0 d 的时间，这表明悬浮细胞诱导愈伤组织的机理与叶片和幼茎都有很大的区别图3 ．1 9 各品种叶片、幼蓬与悬浮细胞之间愈伤组织诱导率差异分析F i g ．3 - 19T h ed i f f e r e n c ea n a l y s i sa m o n gl e a v e s ，y o u n gs t e m sa n ds u s p e n s i o nc e l l so fd i f f e r e n tc u l t i v a r s3 ．5 ．1 ．2 培养基及培养条件对悬浮细胞愈伤组织诱导的影响；通过比较液体培养基和固体培养基愈伤组织的诱导结果发现，在酬体培养基中愈伤组织的诱导率明显要好于液体培养基，1 号品种悬浮细胞在州体培养基中愈伤组织诱导可到2 2 ．0 0 ％，而液体培养基中只有5 ．3 3 ％，9 号品种悬浮细胞在闹体培养基中愈伤组织诱导可到2 6 ．6 7 ％，而液体培养基中仅为2 ．6 7 ％，这表明咧体培养更有利于悬浮细胞愈伤组织诱导，当然，这也有可能是因为未找到更合适的液体培养基造成的。

本研究发现，各月季品种悬浮细胞诱导出的愈伤组织整个过程都是在黑暗条件下得到的，光照条件下不能诱导愈伤组织，这也与叶片和幼茎愈伤组织的诱导过程不同，叶片和幼茎愈伤组织在诱导过程中先进行一定时间的暗培养，待愈伤组织开始发生后再进行光照培养，而进行同样的处理时，悬浮细胞不能诱导愈伤组织这表明，光照条件下不利于悬浮细胞愈伤组织的形成，具体的机理还需要在下一步的：L 作中进行研究3 ．5 ．2 悬浮细胞愈伤组织的分化培养将3 个品种悬浮细胞诱导出的愈伤组织分别接种在愈伤组织分化培养基中进行培养，分化培养基的激素组成参照叶片和幼茎愈伤乡f l 织分化培养基的组成成分培养2 5 d 后，开始统计愈伤组织分化情况，各品种愈伤组织分化的结果如表3 ．1 l 所示4 3东北农业人学农学硕十学位论文表3 ．1 1 各月季揣种悬浮细胞愈伤组织分化结果T a b ．3 - 11T h er e s u l t so fs u s p e n s i o nc e l l sc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o no fd i f f e r e n tr o s ec u l t i v a r s品种培养基( m g ·L 。

)愈伤组织分化状态分化率( ％)C u l t i v a rM e d i u mC a l l u sd i f f e r e n t i a t i o nw a yR a t e，旦M S + 2 ，4 - D O ．2 + T D Z 9 ．0 + G A 3 0 ．1不定芽3 2 ．3 34 - 5 ．0 3M S + 6 ．B A 0 ．5 + 2 ，4 ．D O ．2 + T D Z 8 ．0 + G A 3 0 ．5胚性愈伤5 2 ．3 3 4 - 6 ．8 18 号M S + 2 ，4 一D O ．2 + T D Z 9 ．0 + G A 3 0 ．1胚状体2 6 ．6 74 - 6 ．51o 导M S + 6 一B A 0 ．1 + T D Z 9 ．0 + G A 3 0 ．5胚状体2 4 ．3 3 4 - 5 ．1 3M S + 2 ，4 ．D O ．2 + T D Z 9 ．0 + G A 3 0 ．1胚性愈伤3 8 ．6 7 ±5 ．1 3注：3 次重复，每个处理5 0 块外植体N o t e ：T h r e er e p e a t s ，5 0e x p l a n t se v e r yt r e a t m e n t在月季悬浮细胞愈伤组织分化培养过程中，3 个月季晶种的愈伤组织均发生再分化，并获得再生植株。

其中，l 号品种悬浮细胞愈伤组织在培养基M S + 2 ，4 ．D O ．2m g - L 一+ T D Z 9 ．0m g ·L ．1+ G A 3 0 ．1m g ·L 以上可直接分化出不定芽，分化率可达3 2 ．3 3 ％，在培养基M S + 6 ．B A 0 ．5m g ·L ．1+ 2 ，4 ．D O ．2m g ·L 一+ T D Z 8 ．0m g ·L ．1 + G A 3 0 ．5m g ·L - l 上可诱导出胚性愈伤组织，诱导率可达5 2 ．3 3 ％( 见图3 —2 0 中A 、B ) ；8 号品种悬浮细胞愈伤组织在培养基M S + 2 ，4 ．D O ．2 m g ·L ～+ T D Z 9 ．0m g ·L 一+ G A 3 0 ．1m g ·L 4 上可分化出胚状体，分化率可达2 6 ．6 7 ％，胚状体通过继代培养可得到再生植株( 见图3 ．2 0 中C 、D ) ；9 号品种悬浮细胞愈伤组织在培养基M S + 6 ．B A 0 ．1 m g ·L d+ T D Z 9 ．0 m g ‘L ～+ G A 3 0 ．5 m g ·L - I 上可分化出胚状体，分化率为2 4 ．3 3 ％，胚状体通过继代培养可得到再生植株( 见图3 ．2 0 中E 、F ) ，在培养基M S + 2 ，4 ．D O ．2m g - L ～+ T D Z 9 ．0 r a g ·L 一+ G A 3 0 ．1 m g ·L ．1上可诱导出胚性愈伤组织，分化率为3 8 ．6 7 ％。

3 ．5 ．2 ．1 叶片、幼茎愈伤组织分化与罴浮细朐之间的薯鼻通过与叶片和幼茎愈伤组织分化结果的比较与分析发现，悬浮细胞愈伤组织的分化培养基与与叶片和幼茎愈伤组织分化培养基基本相同，这表明由悬浮细胞诱导出的愈伤组织对激素的反应上与叶片和幼茎愈伤组织的区别不大，但这并不意味着悬浮细胞诱导出的愈伤组织与叶片和幼茎愈伤组织没有区别，悬浮细胞愈伤组织诱导的不定芽和胚状体在形态上与叶片和幼茎愈伤组织都有很大的差别研究中发现，悬浮细胞愈伤组织的分化能力要强于叶片和幼茎愈伤组织，比如l 号品种悬浮细胞愈伤组织分化不定芽的分化率可达3 2 ．3 3 ％，而叶片和幼茎愈伤组织的分化率只有1 8 ．0 0 ％；8 号品种悬浮细胞愈伤组织分化胚状体的分化率能达到2 6 ．6 7 ％，而叶片和幼茎愈伤组织的分化率只有1 8 ．6 7 ％，这表明由体细胞诱导出的愈伤组织具有更好的分化能力3 ．5 ．2 ．2 愈伤组织培养方式对愈伤组织分化的影响研究中发现，由液体培养基诱导出的愈伤组织在愈伤组织分化培养基上均不能发生分化，在分化培养基上愈伤组织呈水渍状，愈伤组织增殖速度慢，继代儿次后基本停止增殖( 见图3 - 2 0 中G ) 这表明由液体培养基诱导出的愈伤组织不适合作为愈伤组织组织分化材料，这可能是由于培养方法的不适宜这种类型的愈伤组织分化培养，适合其分化的培养方法需要进一结果’0 分析步的研究探讨。

3 ．5 ．1 ．3 体细胞再生植株生根培养将体细胞诱导的健壮无菌苗转入到生根培养基上，试验结果表明在1 ／2 M S + N A A 0 ．0 5 m g ／l的生根培养基上生根率及生根的数目均较高，根较粗壮，且幼苗生长强健( 见图3 ·2 0 中H 、I ) 结果表明，体细胞诱导出的无菌苗在生根培养过程中与器官诱导的无菌苗差异不明显，植株形态的著异也不是很大但这只是表观上得出的结论，还需要从生理水平和分子水平上进行分析，才能得出更准确的结论，在’卜．一步的工作中需要进行完善4 5东北农业人学农学硕l ：学位论文磐7 9 t ≯j 够妒移纷“穆．{ j * ，誊，簟☆7够孽9 j 镢4蘩以r⋯：，一．A k 矗7 妻D／，BCoH幽3 ．2 0 现代月季悬浮细胞愈伤组织分化培养过程F i g ．3 ．2 0T h ep r o c e s so fs u s p e n s i o nc e l l sc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o no fm o d e mr o s e s注：A ．1 号品种悬浮细胞愈伤组织分化刁i 定芽：B ．悬浮细胞愈伤组织诱导的胚性愈伤组织( 1 号品种) ；C ．8 号品种悬浮细胞愈伤组织分化胚状体：D ．8 号品种胚状体形成／卜定芽iE ．9 号品种悬浮细胞愈伤组织分化胚状体；F ．9 号品种胚状体分化不定芽；G ．液体培养基诱导的悬浮细胞愈伤组织在分化培养基上的状态( 8号品种) ；H ．体细胞冉生植株生根情况( 8 号品种) ；I ．体细胞再生植株表舭状态( 8 号品种)N o t e ：A ．T h ea d v e n t i t i o u sb u d sd i f f e r e n t i a t e db ys u s p e n s i o nc e l l sc a l l u so fc u l t i v a r1 ：B ．E m b r y o g e n i cc a l l u si n d u c e db ys u s p e n s i o nc e l l sc a l l u so fc u l t i v a rl ：C ．T h es o m a t i ce m b r y od i f f e r e n t i a t e ds u s p e n s i o nc e l l sc a l l u so fc u l t i v a r8 ；DT h es o m a t i ce m b r y of o r m e da d v e n t i t i o u sb u do fc u l t i v a r8 ；E ．T h es o m a t i ce m b r y od i f f e r e n t i a t e db ys u s p e n s i o nc e l l sc a l l u so fc u l t i v a r9 ：F ．T h es o m a t i ce m b r y of o r m e da d v e n t i t i o u sb u do fc u l t i v a r9 ；GT h es t a t eo fs u s p e n s i o nc e l l sc a l l u si n d u c e db yl i q i dm e d i u mo nt h ed i f f e r e n t i a t i o nm e d i u m ( c u l t i v a r8 ) ；H ．T h er o o t i n gr e s u l to fs o m a t i cc e l lr e g e n e r a t i o ns e e d l i n g s ( c u l t i v a r8 ) ：I ．T h ea p p e a r a n c eo f s o m a t i cc e l lr e g e n e r a t i o ns e e d l i n g s ( c u l t i v a r8 )一一磋谚：，一，。

．|『一嗡獗一谚一～哆～勤≯I |Y，pv；k ≯，々、${4；{、，l、#∥％铲≯7∞≮∞等轳；o^≯，‰女∥-％群驴％v羧毒螯蓼牙##舒“私鲈錾讨论4 讨论4 ．1 影响月季愈伤组织诱导和分化的因素状态良好的愈伤组织是植株再生和细胞悬浮系建立的基础，来源于不同植物或同一植物不同部位的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异( 李浚明，2 0 0 2 ) 本研究也发现月季愈伤组织诱导和分化培养过程中基因型、外植体、培养基及培养条件的影响很大4 ．1 ．1 外植体与基因型外植体的类型及其生理状态对愈伤组织的诱导及愈伤组织的再生能力影响巨大虽然叶片、茎段、根及其它器官等都能脱分化形成愈伤组织，但愈伤诱导率及出愈状态差别很大M a r c h a n t 等( 1 9 9 6 ) 采用丰花月季的叶片、叶柄和根诱导愈伤，结果只有叶柄和根得到了胚性愈伤，幼叶愈伤一直保持硬实致密状K i n t z i o s 等( 1 9 9 9 ) 采用四个月季品种的成熟叶片和茎段诱导愈伤，发现只有一个品种的成熟叶片最终获得胚性愈伤，而茎段最终均没有获得胚性愈伤本研究分别以月季无菌苗叶片、幼茎作为外植体进行愈伤组织的诱导和分化，在相同的条件下，各品种叶片愈伤诱导率都要高于幼茎，但在愈伤组织分化培养过程中，幼茎愈伤组织的分化能力强于叶片愈伤组织。

因此，外植体的选择和基冈型要一并考虑，如何选择什么样的外植体诱导愈伤再生潜力入也要据基因型而定一般来说，和成熟的及高度分化的细胞相比，由分生细胞胚细胞产生的愈伤组织具有较高的再生能力，在木本植物中，具有再生能力的愈伤组织主要是由胚外植体得到的( 李浚明，2 0 0 2 ) K a u r 等( 2 0 0 6 ) S H K i m 等( 2 0 0 3 ) 用不成熟胚作为外植体，均获得胚性愈伤和再生植株由于考虑工作量及时间限制，本试验只选择无菌苗的叶片和幼茎作为外植体进行比较分析，数据具有一定的局限性，需要在下一步的工作中进行补充，充分考虑各种外植体比如花瓣、叶柄、根、胚等对愈伤组织诱导和分化的影响虽然已经有很多有关月季愈伤组织诱导及植株再生的报道，但目前还没有一种较普遍的获得良好状态愈伤组织的方法D o h m 等( 2 0 0 1 ) 报道了一种适用5 0 多种月季基冈型的胚性愈伤诱导及植株再生过程，是目前报道中适刚范同最广的愈伤诱导再生过程L i 等( 2 0 0 2 ) 采用’C a r e f r e eB e a u t y ’和’G r a n dG a l a ’基冈型，在相同的条件下诱导愈伤，结果分别获得了柔软松脆的愈伤和便实致密的愈伤，说明基冈型对愈伤诱导结果影响极大。

本研究选用5 个现代月季品种诱导愈伤组织，发现在相同条件下5 个品种的愈伤组织诱导率及诱导状态都存在一定的差异，但都在适宜的培养基上愈伤组织的诱导率都较高，激素种类和浓度的差异并不很大，但5 个品种在愈伤组织分化培养过程中，在相同的培养条件下差异非常明显，各品种愈伤组织分化途径和分化率都不相同，这说明与愈伤组织诱导过程相比，愈伤组织的分化培养过程受更多因素的制约，基因依赖型更大因此，在愈伤组织的分化培养过程中基因型的选择是首先要考虑的因素，针对不同的基因型，愈伤组织分化培养需要对进行各自单独的优化过程4 7东北农业犬学农学硕七学位论文4 ．1 ．2 培养基和培养条件培养基是诱导细胞分裂、控制愈伤组织诱导分化的“把手”( 孙敬山，2 0 0 6 ) 由于植物的遗传特性和生物学特性不同，对培养基的营养成分尤其是激素成分的要求也不同，有时决定愈伤状态的不是生长素／分裂素的比值，而是其绝对浓度，因此激素调控是个相当复杂的问题K u n i t a k e 等( 1 9 9 3 ) 在不附加任何激素的M S 培养基上利用不成熟种子获得了胚性愈伤，本研究中在不附加任何激素的培养基上既不能诱导能形成愈伤，也不能使愈伤组织发生分化，出现这种不同的结果可能是所选基因型和外植体不同造成的，不同基因型的内源激素水平不同，也可能是激素作用的基因位点不同造成的。

近年来越来越多的研究显示2 ，4 ．D 是月季胚性愈伤及体胚诱导中应用最广泛的激素( M a r c h a n t 等，1 9 9 6 ；K i m 等2 0 0 3 ) T D Z 对木本植物的再生培养具有很好的效果，T D Z 具有生长素和细胞分裂素双重作用的特殊功能，在基本培养基M S 上只添加T D z 就能诱导葡萄‘赤霞珠’叶片离体再生( 王华等，2 0 0 4 ) ，J o h n 等( 2 0 0 1 ) 也提出，T D Z 通过促进细胞内嘌呤类细胞激动素的合成或积累而有利于愈伤组织的生长、芽的分化及繁殖的，高莉萍等( 2 0 0 5 ) 先在含2 ，4 ．D 的培养基上诱导愈伤组织，再转入含T D Z 的培养基上，在愈伤保持培养基上继代，经过近一年的选择，获得了颗粒状脆性的胚性愈伤本研究在试验过程中发现2 ，4 ．D 在诱导愈伤组织过程中，不论是愈伤组织诱导率还是愈伤组织的形态都要好于N A A ，在愈伤组织分化培养过程中，T D Z 具有重要的作用，试验过程中发现，单独使用T D Z I 对，可以诱导8 号品种幼誉愈伤组织发生分化，在附加生长素类物质N A A 、2 , 4 ．D 或细胞分裂素6 ．B A 的培养基中均不能使愈伤组织发生分化，与较高浓度的T D Z 组合使用时，则使5 个品种愈伤组织转化成胚性愈伤，分化不定芽或胚状体。

在离体叶片愈伤组织诱导和再生研究中，前期光照条件对愈伤组织的诱导具有重要的作用，一般认为前期暗培养可提供愈伤组织诱导率不同基因型对暗培养的反应不同，也对再生能力有较人的影响本研究在愈伤组织诱导过程中首先进行一周暗培养，然后在放在光照条件- 卜．进行培养，外植体愈伤组织的诱导率得到提高在愈伤组织分化培养过程中发现，光照条件是愈伤组织发生分化是必不可少的，但由于时间原因，本研究没有进行光照强度的优化，愈伤组织在什么样的光照强度下分化率更高还需要进一步的研究4 ．2 愈伤组织的分化途径愈伤组织在离体培养过程中，组织和细胞的潜在发育能力可以在某种程度上得到表达，伴随着反复的细胞分裂，又开始新的分化将脱分化的细胞团或组织经重新分化而产生出新的具有特定结构和功能的组织或器官的一种现象，称为再分化愈伤组织细胞再分化有两种方式，一种是器官发生( o r g a n o g e n e s i s ) ，一种是胚胎发生( e m b r y o g e n e s i s ) ，即在一定的培养条件下，愈伤组织通过分化可以形成不定芽或根的分生组织甚至是胚状体，继而发育成完整的小植株4 ．2 ．1 器官发生途径通过器官发生途径产生再生植株的方式有3 种( K o m a r 等，1 9 8 8 ) ，一是先形成芽，等芽伸实验所一证实。

同时，人们也发现在器官分化过程中对于细胞分裂素和生长素具体要求会因组织种类的不同而有差别该理论认为，细胞分裂素／生长素比值高时促进芽的分化，比值低时有利于细胞增殖和根的分化本研究中愈伤组织分化先诱导出不定芽，再诱导根，从而形成再生植株4 ．2 ．2 体细胞胚胎发生途径体细胞胚的诱导是指从植物外植体诱导体细胞胚，也称为初级体细胞胚胎发生( P r i m a r ye m b r y o g e n e s i s ) 为了保持月季品种的优良性状，体细胞胚的诱导都是以营养器官为外植体的一般由营养器官诱导的体细胞胚发生是间接的在体细胞胚发生过程中，植物体细胞经过分裂和分化形成类似合子胚结构的完整胚，体细胞胚的两级具有芽和根的分生组织，当体胚发育时，也要经历明显的球形期、心形期、鱼雷形期、子叶期和成熟期体细胞胚可直接发生于外植体组织的细胞而不需经历愈伤组织阶段，但是从可扩增的愈伤组织诱导体细胞胚的间接体胚发生途径更为常见( R a e m a k e r s e t a l ，1 9 9 5 ) 本研究在愈伤组织分化培养过程中有两个月季占占种诱导出胚状体，但由于时间原因，并朱深入探讨愈伤组织的诱导胚状体的规律和机理，在下一步的研究过程中需要进行补充研究。

4 ．2 - 3 类原球茎发生途径类原球茎发生途径是近几年研究提出的一种新的月季再生方式，郭艳超等( 2 0 0 8 ) 以香水月季( R o s a o d o r a t a ) 为试验材料，提出了类原球茎再生植株的途径试验以香水月季的无菌叶片为外植体，在2 ，4 ．D 的作用下，高频诱导出类根体，类根体在含T D Z 的培养基上培养l O d后，其顶部由白色变为黄绿色并开始膨人，逐渐分化成带有大量突起结构的类原球茎束，类原球茎束在附；弧I I B A 的培养基上可以逐渐萌发形成正常的再生植株本研究在愈伤组织诱导阶段诱导出类根体，对类根体进行继代培养类根体未发生分化，由于精力有限，并未深入探讨这种再生途径，在以后的工作中可以进行更深入的研究4 ．3 现代月季体细胞培养的影响因素4 ．3 ．1 悬浮培养起始物的选择获得状态良好的愈伤组织才能建立良好细胞悬浮体系，接种的愈伤组织生长状态直接影响悬浮细胞系的质量周春江等( 2 0 0 2 ) 在草莓细胞悬浮培养中通过不断的筛选和改造获得了质地致密淡黄色的愈伤组织，将其转移到液体培养基中进行：悬浮培养，最终获得了稳定的悬浮体系在本试验中共能获得3 种形态的愈伤组织，选择I I 类愈伤组织作为悬浮细胞系建立的材料，这是因为I I 类愈伤组织状态较松散，在震荡培养过释体细胞比其他两个类型愈伤组织更易分散，经过不断筛选和继代培养可以获得稳定的悬浮细胞体系。

4 9东北农业人学农学硕士学位论文4 ．3 ．2 细胞培养与P H 的关系培养液的P H 对胚性悬浮系细胞的生长有很大的影响P H 值会对前体及营养物质的摄取、膜的通透性以及物质从液泡向培养基的释放产生影响( Y e o m a n 等，1 9 9 6 ) 本试验中月季悬浮系细胞培养过程中，P H 值在小范围内出现了随时间的推移不断降低变化趋势且培养基P H的变化与悬浮细胞的生长有相关联系：悬浮细胞培养初期细胞的生长与P H 值的变化呈现负相关，随着细胞增殖速度快，P H 值迅速下降培养后期，当P H 缓慢降低并趋于稳定，细胞生长趋于停滞二者之间的这种关系，可能是在细胞培养过程中，细胞对营养物质具有选择性吸收，从而调控特定基因的表达，促进细胞增长，同时细胞生长过程中释放的代谢物质使培养液中离子浓度不断发生变化，从而影u 癍J P H 值的变化细胞组织有一定的自我凋节能力，在一定范同内细胞组织释放的物质可以凋：1 ，培养基的P H 值至细胞生长的适宜值，但是这种自我调节能力是有限的，超过限度，则不能适应细胞的生长，生长受到抑制4 ．3 ．3 振荡培养转速的影响振荡培养对细胞团施加一种缓和的压力，使细胞和小细胞团在培养液中保持均匀分布，使得它们破碎成小细胞团或单细胞。

亦可促进培养基和容器内空气之间的气体交换振荡培养时的转速会影响细胞的增殖，尤其对细胞团的大小影响显著，进而影响到愈伤组织的分化，因此可以根据需要改变转速，如果要维持胚性细胞悬浮系的快速生长能力，应选择较高转速，如果用于胚性细胞团的再生，应适时降低转速，利于大细胞团的生长，用于进一步固体培养基上的增殖以及后续的分化培养另外，有研究表明细胞团的大小与悬浮系分化能力密切相关冈此应根据不同晶种，选择适当的转速控制细胞团的大小，保证其体细胞胚胎分化再生能力本研究在试验过程中忽视了转速对悬浮细胞培养的影响，这也可能是导致体细胞愈伤组织诱导率偏低的原冈之一4 ．4 褐化现象的控制在植物组织培养中，褐化现象指的是培养材料在诱导脱分化或再分化过程中，向培养基中释放出褐色物质，使其变色，并随之加重变褐而最终死亡的现象( 高国训，1 9 9 9 ) 在完整的组织和细胞中，酚类物质与多酚氧化酶分开，因而比较稳定，获取外植体时，切口处的细胞受到伤害，酚类物质通过生物膜渗透到原生质中，与多酚氧化酶发生氧化反应和自身氧化，被氧化成有毒的醒类物质，酮类物质又在酪氨酸酶的作用下，与外植体中的蛋白质聚合，从而引起其他酶系统失活，导致组织代谢活动紊乱，生长停滞。

褐化现象不仅影响月季外植体与继代植株的正常生长与分化增殖，还影响愈伤组织诱导和分化，在组织培养培过程中往往因为褐化现象严重造成愈伤组织难以继代保存同时，褐化现象还在一定程度上影响试管苗诱导生根，导致植株分化过程中根的形成及发育不良，还有些植株虽形成了根，却冈褐化严重而腐烂死亡，这些都给试管苗最终的移栽成活造成了严重的影响( 张俊琦，2 0 0 6 ) 在培养基中加入防褐化剂是防止外植体褐变的有效方法，常州的防褐化剂有抗氧化剂和吸附剂，抗氧化剂有硫代硫酸钠( N a 2 S Z 0 3 ) 、抗坏血酸( V c ) 、硝酸i f l ( A g N 0 3 ) 和铜h 式齐U ( D D T C ) ，5 l东北农业人学农学硕七学位论文5 结论1 ．建立了5 个现代月季品种快速繁殖体系：1 号月季品种不定芽萌发和增殖的最佳培养基为：M S + 6 ．B A 2 ．5 r a g ·L - N A A O ．0 5 m g ·L 一，增殖率能达到4 ．2 ；2 号、6 号和8 号月季品种最佳培养基为：M S + 6 ．B A 2 ．O m g ·L 一+ N A A O ．0 5 m g ·L - I ，增殖率分别能达到3 ．6 8 、4 ．0 7 和4 ．2 ；9号月季品种最佳培养基为：M S + 6 ．B A 2 ．O m g ·L - 1 + N A A O ．1 m g ·L ．1 ，增殖率可达到3 ．9 9 ；5 个月季品种无菌苗的最适生根培养基为：I ／2 M S + N A A O ．0 5m g ·L “和I ／2 M S + N A A0 ．1 m g ·L 4 ，生根率都可达8 0 ％以上；各品种无菌苗通过驯化炼苗，露地栽植成活率都可达8 8 ％以上。

2 ．筛选出5 个现代月季品种愈伤组织诱导最佳培养基l 号、8 号月季品种叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ．4 ．D 3 ．0m g ·L ．1 ，诱导率均可达到10 0 ．0 0 ％；2 号、6 号、9 号月季品种叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D 2 ．0m g ·L ．1 + 6 ．B A O ．5m g ·L 一，诱导率分别可达到9 7 ．6 7 ％、9 8 ．6 7 ％、1 0 0 ．0 0 ％1 号、6 号月季品种幼茎诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D 3 ．0m g ·L - l ，诱导率分别可达到7 8 ．6 7 ％，8 4 ．3 3 ％；2 号月季品种幼茎诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D 2 ．0m g ·L ”，诱导率可达到7 3 ．6 7 ％：8 号、9 号月季品种幼茎诱导愈伤组织的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D 2 ．O m g ·L ．J + 6 ．B A O ．5 m g - L 一，诱导率分别为8 2 ．3 3 ％、8 0 ．3 3 ％3 ．筛选出4 个现代月季品种愈伤组织分化最佳培养基。

l 号品种叶片愈伤组织分化的最佳培养基为M S + 2 ，4 ．D O ．2m g ·L 一+ T D Z 9 ．0m g ·L ．1 + G A 3 0 ．1m g ·L ．1 ，分化途径为不定芽发生途径，分化率可达1 8 ．0 0 ％；6 号品种叶片愈伤组织分化的培养基为M S + 6 ．B A O ．1m g ·L “+ 2 ，4 ．D I ．0m g ·L ．J + T D Z 8 ．0m g ·L ～+ G A 3 0 ．1m g ·L ～，分化途径为不定芽发生途径，分化率可达2 2 ．o o ％：适合8 号品种叶片愈伤组织分化的培养基为1 ／2 M S + 6 ．B A O ．5m g ·L - 1 + T D Z l 0 ．0m g ·L ～+ G A 3 0 ．1m g ·L 一、M S + 2 ，4 ．D O ．2m g ·L ”+ T D Z 9 ．0m g ·L ．1 + G A 3 0 ．1m g ·L ．1 ，前者愈伤组织分化途径为胚状体途径，胚状体通过继代培养可形成再生植株，后者分化途径为不定芽途径，分化率分别为1 8 ．6 7 ％、2 1 ．3 3 ％，幼茎愈伤组织分化的最佳培养基为M S + T D Z 8 ．0m g ·L ”，分化途径为不定芽发生途径，分化率可达4 6 ．6 7 ％；9 号品种叶片愈伤组织分化的最佳培养基为M S + 6 ．B A O ．1m g ·L ～+ T D Z 9 ．0m g ·L ．1 + G A 3 0 ．5m g ·L ”，分化途径为不定芽途径，分化率达到1 6 ．6 7 ％，幼茎愈伤组织分化的培养基为M S + 2 ，4 ．D O ．2m g ·L ～+ T D Z 9 ．0m g ．L 一+ G A 3 0 ．1m g ·L 一，分化途径为胚状体途径，分化率可达3 5 ．3 3 ％。

4 ．以5 个月季品种的愈伤组织诱导培养基成分相同的液体培养基可建立起稳定的悬浮细胞系，悬浮系最佳的继代时间间隔为8 ．1 0 d ，悬浮系培养后4 ．8 天内的细胞生长旺盛，活性强，适宜用来进行细胞系的再生培养；不同基冈型间月季：悬浮系生长特性差异不显著5 ．以1 号、8 号和9 号三个品种的悬浮细胞可诱导出愈伤组织1 号品种悬浮细胞在固体培养基M S + 6 ．B A O ．1m g ·L ．1 + 2 ，4 ．DI ．0m g ·L ．‘+ K T O ．1m g ·L ．1 ，愈伤组织诱导率为2 2 ．0 0 ％；8号品种悬浮细胞在固体培养基M S + 2 ，4 ．D I ．0m g ·L ．1 + N A A l ．0m g ·L ．1 + K T O ．5m g ·L ．I 愈伤组织诱导率为2 7 ．3 3 ％；9 号品种悬浮细胞在固体培养基M S + 2 ．4 ．D I ．0m g ·L ．‘神蚺A 1 ．0m g ·L ．‘+ K T O ．5m g ·L ．I 愈伤组织诱导率为2 6 ．6 7 ％，悬浮细胞在液体培养基M S + 6 ．B A O ．5m g ·L 一+ 2 ，4 ．D 1 ．0m g ·L - l+ N A A O ．2m g ·L 。

愈伤组织诱导率仅为2 ．6 7 ％6 ．1 号品种悬浮细胞愈伤组织在培养基M S + 2 ，4 ．D O ．2m g ·L ．1 + T D Z 9 ．0m g ·L _ + G A 3 0 ．15 2结论m g ·L 4 上可直接分化出不定芽，分化率可达3 2 ．3 3 ％；8 号品种悬浮细胞愈伤组织在培养基M S + 2 ，4 ．D O ．2m g ·L ～+ T D Z 9 ．0m g ·L - 1 + G A 3 0 ．1m g ·L ．1 上可分化出胚状体，分化率可达2 6 ．6 7 ％；9 号品种悬浮细胞愈伤组织在培养基M S + 6 - B A 0 ．1 m g ·L 1 + T D Z9 ．0 m g ·L - 1 + G A 3 0 ．5 m g ·L - I 上可分化出胚状体，分化率为3 8 ．6 7 ％东北农业大学农学硕r J ：学位论文致谢本论文是在导师车代弟教授的悉心指导下完成的三年来，导师不仅在专业上传授我大量的知识，而且在生活上给予我不倦的教诲和无私的帮助，为我个人的成长倾注了大量的心血导师渊博的知识、开拓的视野、刻苦进取的二I ：作精神、严谨而不呆板的：[ 作方式深深感染着我，给我启迪，使我受益终生。

在论文课题的设计及完成过程中，导师给予我关键性的指导，在此向我的导师车代弟教授致以我最诚挚的敬意和最衷心的感谢在试验和学习生活中得到了东北农业大学园艺学院樊金萍老师悉心的帮助、王金刚老师和龚束芳老师的全力支持，在此表示感谢；对同林实验中心杨涛老师帮助，在此表示感谢；在试验遇剑困难时，得到了张金柱师兄、园林植物与观赏园艺专业桑成瑾、陈雪等同学的大力帮助，在此表示感谢，与你们一起在实验室奋斗的辛苦而义充实的时光我将终生难忘试验过程中还得到了所有的0 9 、l O 届的师弟师妹的协助，你们的热情帮助和默默支持是我试验顺利完成的推动力，谢谢你们!感谢父母对我的扶养和教育，亲情无私，至爱无价，你们是温暖和鼓舞我永远前进的动力!感谢所有支持我、关心我的人们!安利佳，罗希敏，张俊敏等．人参单细胞悬浮培养再生植株【J 】．科学通报，1 9 9 0 ，1 5 ：1 1 8 0 ．11 8 3毕艳娟，高书国，乔亚科，刘钟河，宋利亭，胡敏芬．植物生长调节剂对月季组培萌芽和成芽的影响[ J 】河北农业技术师范学院学报，1 9 9 6 ，l O ( 4 ) ：3 7 - 4 0陈正华．木本植物组织培养及其应用[ M I ．北京：高等教育出版社，1 9 8 6 ，7 5 ．9 1陈俊愉．中国花卉品种分类学[ M 】．中国林业出版社，2 0 0 1崔堂兵，郭勇，张常山．植物组织培养中褐变现象的产生机理及克服方法【J 】．广东农业科学，2 0 0 1 ，3 ：1 6 - 1 8崔林，范银燕．裸燕麦悬浮细胞系的建立及植株再生【J 】．作物学报，1 9 9 7 ，2 3 ( 1 ) ：1 0 7 ．11 0崔凯荣，戴若兰．植物体细胞胚发生的分子生物学[ M 】．北京：科学出版社，2 0 0 0董云洲，段胜军．谷子胚性悬浮细胞系植株再生体系的建立及转基因技术研究[ J 】．应用基础与：J ：程科学学报，1 9 9 9 ( 1 ) ：3 4 ．4 0董云洲．丰抗8 号小麦悬浮细胞系的建立及遗传转化的初步研究【J 】．应用基础与工程科学学报，1 9 9 8 ，6 ( 2 ) ：1 4 0 ．1 4 4费鹏飞，傅玉兰，聚乙烯毗咯烷酮( P V P ) 抑制牡丹组培褐化作片j | 的初步研究[ J 】．2 0 0 6 年中国观赏园艺研究进展：3 5 9 ．3 6 1高国训．植物组织培养中的褐变问题[ J 】．植物生理学通讯，1 9 9 9 ，3 5 ( 6 ) ：5 0 1 ．5 0 6高莉萍，包满珠．月季萨蔓莎不定芽的直接诱导和植株再生的研究【J 】．中国农业科学，2 0 0 5 ，3 8 ( 4 ) ：7 8 4 - 7 8 8顾玉成，吴金平，万进等．魔芋不同外植体诱导比较实验【J 】．中南民族大学学报：自然科学版，2 0 0 4 ，2 3 ( 3 ) ：1 7 ．1 9郭艳超，张倩，田传卫，陈菊，赵梁军．香水月季类原球茎( P L B s ) 途径再生植株的研究【J 】．中国农业大学学报，2 0 0 8 ，1 3 ( 5 ) ：2 9 ．3 4管道平，杨其长，刘文科，肖平，杨建荣．植物光自养微繁技术研究进展[ J 】．园艺学报，2 0 0 6 ，3 3 ( 3 ) ：6 8 0 - 6 8 6何松林，陈笑蕾，陈莉等．牡丹叶柄离体培养中褐化防止的初步研究【J 】．河南科学，2 0 0 5 ，( 1 ) ：4 7 ．5 1何松林，朱道圩，任凝辉，鲁琳，白玉玲，粟纪轩，张艳萍．切花月季‘萨蔓莎’组织培养微繁的研究[ J ] ．华北农学报，1 9 9 6 ，l l ( 3 ) ：l1 7 ．1 2 0黄璐琳，胡尚饮，杨晓．药用植物生物．I ：程研究进展I 组织和细胞培养研究【J 】．中草药，2 0 0 6贾景明，刘永昌等．玉米单细胞培养的研究[ J 】．沈阳师范学院学报，2 0 0 1 ，1 9 ( 2 ) ：4 7 ．5 1焦海华．一品红不同外植体愈伤组织诱导能力的研究[ J 】．浙江师范大学学报：自然科学版，2 0 0 3 ，2 6 ( 1 ) ：6 5 ·6 7郎玉涛，罗晓芳．牡丹愈伤组织的诱导及愈伤褐化抑制的研究，河南林业科技，2 0 0 7 ，2 7 ( 1 ) ：4 - 6赖钟雄，陈振光．龙眼胚性细胞悬浮培养再生植株【J 】．应用与环境生物学报，2 0 0 2 ，8 ( 5 ) ：5 5东北农业大学农学硕十学位论文1 14 8 5 - 4 9 l林玉红．月季试管苗繁殖的研究【J 】．甘肃农业科技，1 9 9 4 ，( 1 ) ：3 6 ．3 7李进，阮颖，刘春林，邓荟芬，范亚丽．月季组织培养和遗传转化体系的研究进展【J 】．西北植物学报，2 0 0 7 ，2 7 ( 7 ) ：1 4 7 9 ．1 4 8 3李名扬，罗金华，陈红．霞草原生质体培养和植株再生【J 】．试验生物学报，1 9 9 6 ，2 9 ( 3 ) ：3 0 5 ．3 1 0李浚明．植物组织培养教程[ M 】．北京：中国农业大学出版社．第2 版，2 0 0 2 ，3 3 ．9 0 ，1 9 0 —2 0 0李风霞，安利佳，张俊敏等．白香草小樨游离培养细胞高频再生植株的激素控制[ J 】．植物学报，1 9 9 3 ，3 5 ( 5 ) ：3 7 4 ．3 7 8刘会超，郭丽娟，贾文庆．月季组织培养研究进展【J 】．河南科技学院学报( 自然科学版) ，2 0 0 7 ，3 5 ( 3 ) ：4 5 —4 7路帖钢，叶和春．细胞悬浮培养．见：孙敬三，桂耀林主编．植物细胞工程试验技术[ M 】．北京：科学出版社，1 9 9 5 。

3 6 ．4 7路铁刚，叶和春．细胞悬浮培养植物细胞工程试验技术【M 】．北京：科学出版社，1 9 9 5 ，3 6 ．4 7罗建平，郑光植．人参培养细胞单细胞克隆的条件培养[ J 】．生物【程学报，1 9 9 5 ，1 1 ( 1 ) ：5 8 ．6 2马和平，臧建成，李毅，吴袖荣．生物技术在林木育种中的应用[ J 】．河北林果研究，2 0 0 5 ．2 0 ( 4 ) ：3 4 3 - 3 6 5马锋旺，李嘉瑞．山桃原生质体培养再生愈伤组织[ J 】．西北农业学报，1 9 9 9 ．2 8 0 ) ：7 3 ．7 6梅兴国，潘学武，董妍玲等．高产紫杉醇红豆杉细胞系的紫外诱变筛选[ J 】．华中科技大学学报，2 0 0 l ，2 9 ( s u p ．I ) ：4 8 ．5 1乔拉HS ．植物生物技术导论( 影印版) 【M 】．北京：科学出版社，2 0 0 4任桂芳，王建红，冯慧，李毅，李燕，施雪波．现代月季( R o s ah y b r i d a ) 叶片植株再生体系的建立【J 】．园艺学报，2 0 0 4 ，3 1 ( 4 ) ：5 3 3 ．5 3 6邵宏波，初立业．禾本科植物细胞悬浮培养和影响胚胎发牛- 的／L 个冈素[ J 】．生物技术通报，1 9 9 0 ，( 3 ) ：l ·5孙敬山，朱至清主编．2 0 0 6 ．植物细胞：1 ：程实验技术【M 】．北京：化学工业出版社．5 3童再康，朱玉球，王章荣．厚朴组织培养与高产细胞系建立的研究【J 】．南京林业大学学报：自然科学版，2 0 0 2 ，2 6 ( 7 ) ：2 3 ．2 6涂艺声，江洪如，王碧琴．草珊瑚细胞悬浮培养之研究【J 】．江西科学，1 9 9 4 ，( 3 ) ：1 6 2王海波．植物组织培养及细胞培养通用分析模式的探讨【D 】．北京：中国农业科学院，1 9 9 6 ，2 9 ( 6 ) ：8 - 1 4王仲英，王艺，童德中．生物技术在果树上的应用【J 】．世界农业，1 9 9 7 ，1 2 ( 2 2 4 ) ：2 0 ．2 3王蒂．植物组织培养[ M 】．中国农业出版社．2 0 0 4 ：1 0 6 ．1 0 8王华，崔福君，张继澍．酿酒葡萄‘赤霞珠’叶片和叶柄离体再生系统建立的研究．西北农林科技大学学报，2 0 0 4 ，3 2 ( 8 ) ：4 9 ．5 2吴晓霞，陈刚，张彪等．植物组织培养中褐变的研究进展【J 】．河北林果研究，2 0 0 2 ，1 7 ( 3 ) ：2 8 4 ．2 8 8邢登辉，吴琴生，刘大钧．黑麦胚性悬浮细胞系的建立和植株再生【J 】．作物学报，1 9 9 5 ．2 l ( 6 ) ：4 2 6 - 4 2 8余舜武，朱永生，余毓君等．快速建立胚性细胞悬浮系的培养程序初探[ J 】．华中农业大学．学报，2 0 0 1 ，2 0 ( 4 ) ：3 2 5 ．3 2 8于守超，赵兰勇，王芬等．植物组织培养过程中外植体褐变机理研究进展[ J 】．山东林业研究，2 0 0 4 ，1 5 4 ( 5 ) ：6 1 ．6 3张喜舂，吴绛云．软枣猕猴桃悬浮细胞系的建立及其影响因索【J 】．B u l l e t i no fB o t a n i c a lR e s e a r c h ，1 9 9 1 ，l l ( 3 ) ：7 7 —8 3张春喜，吴绛云．软枣猕猴桃细胞系的建立及其影响因素【J 】．植物学研究，1 9 9 1 ，1 l ( 3 ) ：7 7 ．8 3张晓东，林延安．首稽细胞悬浮培养与耐受高浓度P E G 变异体的筛选[ J 】．核农学报，1 9 9 4 ，8 ( 1 ) ：7 ·13张进仁，陈善春，高峰．柑橘细胞悬浮培养及再生植株的研究[ J 】．热带作物学报，1 9 9 3 ，14 ( 2 ) ：6 7 ·7 0张绮纹，张望东．群众杨3 9 无性系耐盐悬浮细胞系的建立和体细胞变异体完整植株的诱导【J 】．林业科学研究，1 9 9 5 ，8 ( 4 ) ：3 9 5 - 4 0 1张俊琦，罗晓芳．牡丹组培中褐化的发生原因与防治方法的研究【J 】．沈阳农业大学，2 0 0 6 ，3 7 ( 5 ) ：7 2 0 - 7 2 4郑玉梅．月季再生体系与p B i n E T R I 转化初探．中国农业大学硕士学位论文，2 0 0 4 ，8郑玉梅，刘青林．月季遗传转化研究进展[ J 】．中国生物工程杂志，2 0 0 3 ，2 3 ( 2 ) ：7 9 ·8 2周春江，李卫东，葛会波等．草毒悬浮细胞系的建立及某些影响因素[ J 】．植物生理学通讯，2 0 0 2 ，3 8 ( 1 ) ：2 2 —2周俊辉，周家容，曾浩森等．园艺植物组织培养中的褐化现象及抗褐化研究进展【J 】．园艺学报，2 0 0 0 ，2 7 ( 增刊) ：4 8 1 ．4 8 6周俊彦．植物体细胞在组织培养中产生的胚状体二：影响植物胚胎发生和发展的因素【J 】．植物生理学报，1 9 8 2 ，8 ( 1 ) ：9 1 ．9 9曾慧，何新民．甘蔗突变新品系梓辐选育初报[ J 】．广西农业科学．1 9 9 6 ．5 ：2 2 0 ．2 2 2张秀省，张荣涛，曹岚等．E M S 诱变的长春花细胞系突变研究【J 】．中草药，2 0 0 4 ，2 5 ( I1 ) ：1 2 9 3 一1 2 9 6A r e n eL ，P e l l e g r i n oC ，G u d i nS A ．C o m p a r i s o no ft h es o m a c l o n a lv a r i a t i o nl e v e lo fR o s ah y b r i d aLC VM e i r u t r a lp l a n t sr e g e n e r a t e df r o mc a l l u so rd i r e c ti n d u c t i o nf r o md i f f e r e n tv e g e t a t i v ea n de m b r y o n i ct i s s u e s [ J ] ．E u p h y t i c a ，1 9 9 3 ，( 7 1 ) ：8 3 - 9 0B a m aK S ，W a k h l uA K ．E f f e c t so ft h i d i a z u r o no nm i c r o p r o p a g a t i o no fr o s e [ J ] ．I nV i t r oC e l lD e vB i o lP l a n t ，1 9 9 5 ，3 l ( 1 ) ：4 4 - 4 65 7东北农业人学农学硕十学位论文B r e s s a nPH ．e t a l ．F a c t o r sa f f e c t i n gi nv i t r op r o p a g a t i o no fr o s e [ J ] ．J ．A m e r ．S o c ．H o r t ．S c i ．，19 8 2 ，10 7 ( 6 ) ：9 7 9 —9 9 0B o u tG ＆S a r n a n t a r a vS ，M o t t l e yJ ，e ta 1 ．B i o t e c h n o l o g yo ft h er o s e ：ar e v i e wo fr e c e n tp r o g r e s s [ J ] ．S c i e n t i aH o r t i c u l t u r a e ，1 9 9 9 ，8 1 ( 3 ) ：2 0 1 - 2 2 8C a l h e i r o sM B P ，V i e i r aL G E ，F u e n t e sS R L ．E f f e c t so fe x o g e n o u sp o l y a m i n e so nd i r e c ts o m a t i ce m b r y o g e n e s i si nc o f f e e [ J ] ．R i v i s t aB r a s i l e i r ad eF i s i o l o g i aV e g e t a l ，1 9 9 4 ，6 ( 2 ) ：10 9 - 1 14CAMM a r c e l i s - V a nA c k e r , HJS c h o l t e n ．D e v e l o p m e n to fa x i l l a r yb u d so fr o s ei nv i t r o [ J ] ．S c i a t i c aH o r t i c u l t u r e ，19 9 5 ，( 6 3 ) ：4 7 —5 5C a s t i l l o nJ ，K a m oK ．M a t u r a t i o na n dc o n v e r s i o no fs o m a t i ce m b r y o so ft h r e eg e n e t i c a l l yd i v e r s er o s ec u l t i v a r s [ J ] ．H o r t s c i e n c e ，2 0 0 2 ，( 3 7 ) ：9 7 3 ·9 7 7C u r r i n d e rS ，C h e e m a ．S o m a t i ce m b r y o g e n e s i sa n dp l a n tr e g e n e r a t i o nf r o mc e l ls u s p e n s i o na n dt i s s u ec u l t u r eo fm a t u r eH i m a l a y a np o p u l a r ( P o p u l u sc i l i a t a ) ．P l a n tC e l lr e p o r t s ，19 8 9 ，8 ：12 4 —12 7D a v i n aL l o y d ．A n d r e wV ．R o b e r t sa n dK e i t hC ．S h o r t ．T h ei n d u c t i o ni nv i t r oo fa d v e n t i t i o u ss h o o t si nR o s a [ J ] ．E u p h y t i c a , 1 9 8 8 ，3 7 ( 1 ) ：3 l ·3 6D ev r i e sD P , D u b o i sL A M ．R o s eb r e e d i n g ：p a s t ，p r e s e n t ，p r o s p e c t s [ J ] ．A c t aH o r t i c u l t u r a e ，1 9 9 5 ，4 2 4 ：2 4 1 - 2 4 7D eW i tJC ，E s e n d a mHF ，H o r k a m e nJJ ，e ta 1 ．S o m a t i ce m b r y o g e n e s i sa n dr e g e n e r a t i o no ff l o w e r i n gp l a n t si nr o s e [ J ] ．P l a n tC e l lR e p ，19 9 0 ，9 ：4 5 6 - 4 5 8D o h mA ．，L u d w i gC ，N e h r i n gK ，D e b e n e rT ．S o m a t i ce m b r y o g e n e s i si nr o s e s [ J 】．A c t aH o r t ，2 0 0 1 ，( 5 4 7 ) ：3 4 1 —3 4 6D o u g l a sGC ．，R u t l e d g eCB ，C a s e yAD ，D a v i dH ．S ．R i c h a r d s o n ．M i c r o p r o p a g a t i o no ff l o r i b u n d a ，g r o u n dc o v e ra n dm i n i a t u r er o s e s [ J ] ．P l a n tc e l l ，T i s s u ea n dO r g a nC u l t u r e ，1 9 8 9 ，1 9 ( 1 ) ：5 5 ．6 4D u b o i sL A M ，D eV r i e sD P ，e ta 1 ．T h ed i r e c tr e g e n e r a t i o no fa d v e n t i t i o u sb u d so nl e a fe x p l a n t so f g l a s sh o u s eg r o w nc u tr o s ec u l t i v a r s [ J ] ．A c t aH o r t i c u l t u r a e ，19 9 6 ，( 4 2 4 ) ：3 2 7 - 3 3lD u r z a nDJa n dG u p a t aPK ．S o m a t i ce m b r y o g e n e s i sa n dp o l ye m b r y o g e n e s i si nD o u g l a sf i rc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e ．P l a n tS c i ，19 8 7 ，5 2 ：2 2 9 ·2 3 5E l l i o t tR F ．A x e n i cc u l t u r eo fm e r i s t e mt i p so fR o s am u l t i f l o r a [ J ] ．P l a n t a , 19 7 0 ，( 9 5 ) ：18 3 - 18 6E s t a b r o o k sT ’B r o w n eR ，D o n gZ h o n g m i n ．2 , 4 ，5 一T r i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i dp r o m o t e ss o m a t i ce m b r y o g e n e s i si nt h er o s ec u l t i v a r ‘L i v i n ’E a s y ’( R o s as p ．) 【J 】．P l a n tC e l lR e p ，2 0 0 7 ，( 2 6 ) ：1 5 3 ．1 6 0G a m b o r gOL ，S h y l u kJP ．N u t r i t i o nm e d i aa n dc h a r a c t e r i s t i c so fp l a n tc e l la n dt i s s u ec u l t u r e s ，I n ：T h o r p eTA ，e d ．P l a n tT i s s u eC u l t u r e ：M e t h o d sa n dA p p l i c a t i o ni nA g r i c u l t u r e ．N e wY o r k ：A c a d e m i cP r e s s19 81 ：8 3 ．8 5G e n o u dC ，C o u d r e tA ，A m a l r i cCa n dS a l l a n o nH ．E f f e c t so fm i c r o p r o p a g a t i o nc o n d i t i o n so fr o s es h o o t l e t s o nc h l o r o p h y l lf l u o r e s c e n c e [ J ] ．P h o t o s y n t h e t i c a , 19 9 9 ，3 6 ( 1 - 2 ) ：2 4 3 —2 51G r e e nCE ．S o m a t i ce m b r y o g e n s i sa n dp l a n tr e g e n e r a t i o nf r o mt h ef r i a b l ec a l l u so f Z e am a y s ．P l a n tT i s s u eC u l t u r e s ，19 8 2 ，10 7 ．10 85 81 9 6 7 ，( 21 6 ) ：5 9 6 ·5 9 7H o r nW A H ．M i c r o p r o p a g a t i o no fr o s e ( R o s aL ) ．I n ：B a j a jY P S ，e d i t o r ．B i o t e c h n o l o g yi na g r i c u l t u r ea n df o r e s t r yV o l2 0H i g h - t e c ha n dm i c r o p r o p a g a t i o nI V ．G e r m a n y 7S p r i n g e r , 19 9 2 ．2 0 ：3 2 0 ．3 4 2H s i aC ，K o r b a nS S ．O r g a n o g e n e s i sa n ds o m a t i ce m b r y o g e n e s i si nc a l l u sc u l t u r e so fR o s ah y b r i d aa n dR o s ac h i n e n s i sm i n i m a [ J 】．P l a n tC e l lT i s s u eO r g a nC u l t ，19 9 6 ，( 4 4 ) ：1 - 6H u a n c a r u n a ，P e r a l e sE ，S c h i e d e r ．P l a n tr e g e n e r a t i o nf r o mp r o t o p l a s t so fa p p l e ．P l a n tC e l l ，T i s s u ea n dO r g a nC u l t u r e ，19 9 3 ，3 4 ：71 - 7 6H u i t e m aJB M ，P r e i lW ：G u s s e n h o v e nGC ，S c h n e i d e r e i tM ．M e t h o d sf o rs e l e c t i o no fl o wt e m p e r a t u r et o l e r a n tm u t a n t so fC h r y s a n t h e m u mm o r i f o l i u mR a m a t ．U s i n gi r r a d i a t e dc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e s ．I ．S e l e c t i o no fr e g e n e r a t e si nv i t r ou n d e rs u b o pt i m a lt e m p e r a t u r ec o n d i t i o n s ．P l a n tB r e e d i n g ，1 9 8 9 ，1 0 2 ：1 4 0 - 1 4 7H u i t e m aJB M ，P r e i lW ：D eJJ ．．M e t h o d sf o rs e l e c t i o no fl o wt e m p e r a t u r et o l e r a n tm u t a n t so fC h r y s a n t h e m u mm o r i f o l i u mR a m a t ．U s i n gi r r a d i a t e dc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e s ．I I I ．C o m p a r i s o no fm u t a n t ss e l e c t e dw i t ho rw i t h o u tp r e s e l e c t i o ni nv i t r oa tl o wt e m p e r a t u r e ．P l a n tB r e e d i n g ，19 91 ，1 0 7 ：1 3 5 ．1 4 0I n o u eM ，M a e d aE ．S t i m u l a t i o no fs h o o tb u da n dp l a n t l e tf o r m a t i o ni nr i c ec a l l u sc u l t u r e sb yt w o - s t e pc u l t u r em e t h o du s i n ga b s e i s i ca c i da n dk i n e ·t i n ．J a p a nJC r o pS c i ，19 81 ，5 0 ：318 —3 2 2K a u rN ，P a t iPK ，S h a r m aM ，A h u j aP ⋯S2 0 0 6 ．S o m a t i ce m b r y o g e n e s i sf r o mi m m a t u r ez y g o t i ce n b r y o so f r o s ab o u r b o n l a n aD e s p + 【J 】．I nV i t r oC e l l ．D e v ．B i o l —P l a n t ( 4 2 ) ：1 2 4 —1 2 7K i mSW ，C ．O hS ，L i uJR ．2 0 0 3 ．C o n t r o lo fd i r e c ta n di n d i r e c ts o m a t i ce m b r y o g e n e s i sb ye x o g e n o u sg r o w t hr e g u l a t o r si ni m m a t u r ez y g o t i ce m b r y oc u l t u r e so fr o s e [ J ] ．P l a n tC e l l , T i s s u ea n dO r g a nC u l t u r e ．( 7 4 ) ：6l 一6 6K i n t z i o sS ，H i u r e a sqS h o r t s i a n i t e sE ，S e r e t iE ，B l o u h o sP ，M a n o sC ，M a k iO ，T a r a v i r aN ，D r o s s o p o u l o sJ ，H o l e v a sCD ．T h ee f f e c to fl i g h to nt h ei n d u c t i o n ，d e v e l o p m e n ta n dm a t u r a t i o no fs o m a t i ce m b r y o sf r o mv a r i o u sh o r t i c u l t u r a la n do r n a m e n t a ls p e c i e s [ J ] ．A c t aH o r t i c u l t u r a e ，1 9 9 8 ，( 4 6 1 ) ：4 2 7 —4 3 2K i n t z i o sS ，M a n o sC ，M a k r iO ．S o m a t i ce m b r y o g e n e s i sf r o mm a t u r el e a v e so fr o s e ( R o s as p p ．)【J 】．P l a n tC e l lR e p ，19 9 9 ，( 18 ) ：4 6 7 —4 7 2K o v a l e n k oPG ，G a l k i nAP ．P r e p a r a t i o no fv i a b l ep r o t o p l a s t sf r o mg r a p e v i n ec a l l u ss u s p e n s i o nc u l t u r ea n ds u b s e q u e n tr e g e n e r a t i o nt op l a n t s ．P l a n tt i s s u ea n dC e l lC u l t u r e ，19 9 0 ，1 lO ：9 3 ．1 1 1K u m a rAS ，OLG a m b o r g , MVN a b o r s ．P l a n tr e g e n e r a t i o nf r o mc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e so fV i g n aa x o n i t i f o l i aP l a n tC e l lR e P , 19 8 8 ，7 ：13 8 ·141K u m a rA ，S o o dA ，P a l n iU T ’G u p t aA K ，P a l n iL M S ．M i c r o p r o p a g a t i o no fR o s ad a m a s c e n a5 9东北农业大学农学硕十学位论文M i l lf r o mm a t u r eb u s h e su s i n gt h i d i a z u r o n [ J ] ．H o r t i cS c iB i o t e c h n o l ，2 0 0 1 ，7 6 ( 1 ) ：3 0 - 3 4K u m a rAS ，O LG a m b o r g ，MVN a b o r s ．P l a n tr e g e n e r a t i o nf r o mc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e so fV i g n aa x o n i t i f o l i a [ J ] ．P l a n tC e l lP e p ，1 9 8 8 ，7 ：1 3 8 - 1 4 1K u n i t a k eH ，I m a m i z oH ，M i iM ．S o m a t i ce m b r y o g e n e s i sa n dp l a n tr e g e n e r a t i o nf r o mi m m a t u r es e e d —d e r i v e dc a l l io f r o s e ( R o s ar u g o s aT h u n b ) [ J 】．P l a n tS c i ，1 9 9 3 ，( 9 0 ) ：1 8 7 - 1 9 4L iXQ ，K r a s n y a n s k iSF ，K o r b a nSS ．S o m a t i ce m b r y o g e n e s i s ，s e c o n d a r ys o m a t i ce m b r y o g e n e s i s ，a n ds h o o to r g a n o g e n e s i si nR o s a 【J 】．Jo fP l a n tP h y s i o l o g y ，2 0 0 2 ，( 15 9 ) ：313 —319M a r c h a n t ＆D a v e yM 凡L u c a sJ A ，P o w e rJ B ．S o m a t i ce m b r y o g e n e s i sa n dp l a n tr e g e n e r a t i o ni nF l o r i b u n d ar o s e ( R o s ah y b r i d aL ) C V ST r u m p e t e ra n dG l a dT i d i n g s [ J ] ．P l a n tS c i ，1 9 9 6 ，( 1 2 0 ) ：9 5 ．1 0 5M u r a l iS ，S r e e d h a rD ，L o k e s w a r iT S ．R e g e n e r a t i o nt h r o u g hs o m a t i ce m b r y o g e n e s i sf r o mp e t a ld e r i v e dc a l l io fR o s ah y b r i d aL ．C VA r i z o n aIh y b r i dt e a [ J ] ．E u p h y t i c a , 19 9 6 ，( 91 ) ：2 71 - 2 7 5N o r i e g aC ，S o n d a h lM R ．S o m a t i ce m b r y o g e n e s i si nh y b r i dt e ar o s e s [ J 】．B i o t e c h n o l o g y ，1 9 9 1 ，( 9 ) ：9 91 ·9 9 3N y m a nM ，W a l l i nA ．P l a n tr e g e n e r a t i o nf r o ms t r a w b e r r y ( F r a g a r i aXa n s s a ) m e s o p h y l lp r o t o p l a s t s ．P l a n tP h y s i o l ，l 9 8 8 ，13 ：3 7 ·3 7 7P a t a tO c h a t tEM ，B o u o n c G i b o dJ ，D u r o nM ，e ta i ．O r g a n o g e n s i so fs t e ma n dl e ap r o t o p l a s t so fah a p l o i dg o l d e nd e l i c i o u ea p p l ec l o n e ( M a l u s x d o m e s t i co r k h ) ．P l a n tC e l lR e p o r t s ，1 9 9 3 ，1 2 ：1 1 8 ．1 2 0P a t iPK ，S h a r m aM ，S o o dA ，A h u j aP S ．D i r e c ts h o o tr e g e n e r a t i o nf r o ml e a fe x p l a n t so fRd a m a s c e n aM i l l [ J ] ．I nV i t r oC e l lD e vB i o lP l a n t ．2 0 0 4 ，4 0 ( 2 ) ：19 2 ·19 5R a e m a k e r sCJ JM ，J a c o b s e nE ，V i s s e rRGF ．S e c o n d a r ys o m a t i ce m b r y o g e n e s i sa n da p p l i c a t i o n si np l a n tb r e e d i n g ．E u p h y t i c a ，19 9 5 ，81 ：9 3 - 10 7：P r a t a pK u m a rP a t i ，M a d h uS h a r m a , A n i lS o o da n dP a r a m v i rS i n g hA h u j a ．M i c r o p r o p a g a t i o no fr o s ad a m a s c e n aa n dR ．b o u r b o n i a n ai nl i q u i dc u l t u r e s [ M ] ．L i q u i dC u l t u r eS y s t e m sf o ri nv i t r oP l a n tP r o p a g a t i o n ，2 0 0 5 ：3 7 3 - 3 8 5P r e i lW ：H u t t e m aJB M ，D eJJ ．M e t h o d sf o rs e l e c t i o no fl o w - t e m p e r a t u r et o l e r a n tm u t a n t so fC h r y s a n t h e m u mm o r i f o l i u mR a m a t ．U s i n gi r r a d i a t e dc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e s ．I I ．P r e s e l e c t i o ni nv i t r ou n d e rl o w e r t e m p e r a t u r es t r e s s ．P l a n tB r e e d i n g ，1 9 9 1 ，1 0 7 ：1 3 l ·1 3 4R o b e r t sA M ，L e w i sR ，M o r i s o tA ，e ta 1 ．R o s eP h e n o t y p e s ：q u e s t i o n so fd i v e r s i t ya n dd e v e l o p m e n t ．A c t aH o r t i c u l t u r a e ，19 9 6 ，( 4 2 4 ) ：313 ·319R o u tG R ，D e b a t aB K ，D a sP ．S o m a t i ce m b r y o g e n e s i si nc a l l u sc u l t u r e so fR o s ah y b r i d aLC VL a n d o r a [ J ] ．P l a n tC e l lT i s s u eO r g a nC u l t ，19 9l ，( 2 7 ) ：6 5 - 6 9R o u tG ＆S a m a n t a r a y sS ，M o t t l a yJ ，e t a l ．B i o t e c h n o l o g yo ft h er o s e ：ar e v i e w o fr e c e n tp r o g r e s s [ J ] ．S c i ．H o r t ，1 9 9 9 ，8 1 ：2 0 1 - 2 2 8S a l mT P M ，T o o mC J G ，e ta 1 ．T h ee f f e c t so fe x o g e n o u sa u x i na n dr o lg e n e so nr o o tf o r m a t i o ni nR o s ah y b r i d aL ．‘M o n e y w a y ’．P l a n tG r o w t hR e g u l a t i o n ，1 9 9 6 ，1 9 ( 2 ) ：1 2 3 ·1 3 1附录I附录试验材料所用的月季品种图片6 l东北农业大学农学硕士学位论文英文缩写词表E n g l i s ha b b r e v i a t i o no u t l i n e攻读学位期间发表的学术论文攻读学位期间发表的学术论文潘兵兵，杨涛，张金柱，车代弟+ ．耐寒丰花月季品系‘2 0 0 4 —6 ’组织培养快速繁殖的研究．中国观赏园艺研究进展2 0 1 0 ．5个现代月季品种愈伤组织再生体系的建立与体细胞培养的研5个现代月季品种愈伤组织再生体系的建立与体细胞培养的研究究作者：潘兵兵学位授予单位：东北农业大学 本文链接：。