HPLC法测定乌药中异乌药内酯的含量.doc

HPLC法测定乌药中异乌药内酯的含量【摘要】 目的 建立用HPLC法测定乌药中异乌药内酯含量的方法方法 色谱柱为Kromasil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相：甲醇-乙腈-水(35:25:40,v/v);检测波长:235nm;柱温：40℃;流速：1ml/min结果 异乌药内酯的进样量在0.15～1.52μg(r=0.9997，n=6)的范围内与峰面积呈良好的线性关系;平均回收率为98.81%，RSD为1.52%结论 该法简单、可靠，可作为控制乌药药材质量的参考标准 【关键词】 乌药;异乌药内酯;高效液相色谱法　【Abstract】 Objective To establish a method for determination of isolinderalactone in Radix linderae by RP-HPLC.Methods The sample was separated on Kromasil C18 (250mm×4.6mm，5μm) column.The mobile phase was ethanol-acetonitrile -water (35∶25∶40,v/v) at a flow rate of 1.0 ml/min and the detection wavelength was 235 nm and the column temperature was 40 ℃.Results The calibration carves were linear in the range of 0.15～1.52μg (r=0.9997,n=6).The average recoveries of isolinderalactone were 98.81% ，RSD were 1.52%.Conclusion The method is simple，accurate，reproducible and can offer referenees for the quality control of Radix linderae.　　【Key words】 Radix linderae; isolinderalactone; high performance liquid chromatography　　乌药为樟科植物乌药Lindera aggregata(Sims)Kosterm.的干燥块根[1]，为常用的理气药。

其现代研究多注重于生药的化学成分及药理作用的研究[2～4]，目前有关乌药含量测定的文献报道甚少[5，6]，而药材中异乌药内酯含量测定的方法目前尚无报道为了更加有效地控制乌药药材质量，笔者首次建立了测定乌药中异乌药内酯的RP- HPLC含量测定方法，并在此基础上对不同产地的乌药药材的含量进行了比较　　1 实验材料　　1.1 仪器 Agilent110高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司);分析天平DT-100(北京光学仪器厂);电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂);不锈钢电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂);KQ-600型超声波清洗器(昆山市淀山湖检测仪器厂)　　1.2 药品与试剂 异乌药内酯 [上海顺勃生物工程技术(云南)公司，供含量测定用，纯度为99.9%，200711];甲醇(色谱纯，天津市密欧化学试剂有限公司，20080129);乙腈(色谱纯，天津市密欧化学试剂开发中心，20051012);其余试剂均为分析纯，水为注射用水乌药药材采于湖南省邵东以及安徽等地，经湖南中医药大学第一附属医院药检室鉴定为樟科植物乌药Lindera aggregata(Sims)Kosterm.的干燥块根。

　　2 异乌药内酯的含量测定　　2.1 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18 柱(250 mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇-乙腈-水(35:25:40,v/v);检测波长:235nm;柱温：40℃;流速：1ml/min　　2.2 对照品的制备 精密称定异乌药内酯对照品0.0019g,置25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml中含异乌药内酯76μg)　　2.3 样品制备 取供试品，将其粉碎成细粉，取1g，精密称定，置50ml锥形瓶中，加甲醇50ml，称重，超声15min(功率250W，频率20kHz)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液，备用　　2.4 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积值Y为纵坐标，以对照品的进样量X(mg)为横坐标进行线性回归，回归方程为：Y=384.6900X+4.9856，r2=0.9993　　结果表明异乌药内酯的进样量在0.15～1.52μg的范围内与峰面积呈良好的线性关系。

　　2.5 精密度实验 分别精密吸取对照品溶液10μl,重复进样6次其异乌药内酯峰面积的RSD为1.88%　　2.6 稳定性试验 取当日配制的供试品溶液，于0、1、2、4、8、24h分别进样10μl，测定样品中异乌药内酯峰面积的RSD值为2.30%试验结果表明，供试液在24h内稳定性良好　　2.7 重复性试验 取同一批供试品，按2.3项下方法，分别制备供试液6份，每份进样10μl，测定峰面积并计算含量，异乌药内酯的平均含量为3.16mg/g，RSD值分别为1.89%　　2.8 加样回收率 称取已知含量的供试品(含12.00%的水分，异乌药内酯含量3.16mg/g)约0.5g 6份，精密称定，分别置50ml锥形瓶中，精密加入一定量的对照品，加甲醇50ml，称重，按2.3项下操作，分别制得供试液，以上述色谱条件测定含量，平均回收率为98.81%，RSD为1.52%结果见表1表1 异乌药内酯的加样回收率试验　　2.9 样品测定 取不同产地批次(分别来源于安徽，湖南邵东市售及自采)的供试品，按“2.3”项下的操作，进行测定，结果见表2(按干燥品计算),色谱图见图1表2 乌药供试品测定　　3 讨论　　通过考察不同提取溶媒、不同提取方法、不同浸泡时间及不同提取时间对异乌药内酯提取效率的影响，最终选择甲醇作为提取溶媒;同时因为超声提取效率较高，且方法简便，所以采用该法为提取方法;考察震摇10min、超声15、30、60、90min，最终确定提取时间为超声15min;考察浸泡0、1、4、8、24h，因为差异无显著性，最终确定无需浸泡。

　　实验先后选择了甲醇-水(45∶55)、乙腈-水(45∶55，v/v)、甲醇-乙腈-水(35∶15∶40，v/v)为流动相，从分离情况和峰形等综合分析，认为甲醇-乙腈-水(35∶15∶40，v/v)作为流动相条件时分离效果较为理想 A B　　A 乌药供试品(sample of Radix Linderae);B异乌药内酯对照品(isolindetalactone　　reference substances);1 异乌药内酯(isolindetalactone)　　图1 高效液相色谱图　　Fig 1 HPLC chromatograma　　本实验首次建立了异乌药内酯的含量测定方法，应用反相高效液相色谱法，以甲醇-乙腈-水作为流动相，可使乌药中的异乌药内酯较好的分离出来，该方法具有简单、稳定、可靠的特点参考文献】 　1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:化学工业出版社,2005：53.　　2 谷丽华，吴纲，张紫佳，等.应用薄层色谱-生物自显影技术评价乌药等三种中药的抗氧化活性.药学学报,2006,41(10):956-962.　　3 Wang N,Minatoguchi S,Arai M,et al. Lindera strychnifolia is protective against post-ischemic myocardial dysfunction through scavenging hydroxyl radicals and opening the mitochondrial KATP channels in isolated rat hearts. Am J Chin Med,2004,32(4):587.　　4 刘卫东，温中京，郭伟娣，等.乌药提取物抗疲劳作用的实验研究,浙江中医杂志，2006，41(7):428-429.　　5 程显隆,魏锋,冯玉飞,等.RP-HPLC法测定乌药中乌药醚内酯和乌药内酯的含量,药物分析杂志， 2003，23(3)：225-227.　　6 蔡立红,俞桂新,王峥涛,等.高效液相色谱法测定乌药中乌药醚内酯的含量,中国中药杂志，2004，29(7)：657-659.。