苏云金芽孢杆菌vip3a基因鉴定、克隆及杀虫活性的分析.pdf

摘要本职究系统地进行了v ≯捌基因的P C R —R F 糟( 多聚酶链反应限制性片段长度多态性) 蘩定，目前，函内外还未觅正式报道通过此方法对实验室保存的6 0 6 株苏云金芽孢秆菌( 曰甜c 川螂f A “砌嘿陋脚拈，简称B t ，) 菌撩的v 瓣妇( 营养期摹虫援瞧；v 臻)基因型进行了鉴定；对擞A L 和B t 4 { 聪B l 蕊株搿含的c 秽和r 和鲥基因型主挂行了鉴 定；完成了蔼株B t A L 蟑d 省基阂的克陵、表这及时甜菜夜蛾( 勋却据M 甜嚼∞) 、 稀铃蛰t №{ t c 洲e r p an r m t g e r G ) 、小蒜蛾tP i H t e l i n 础l o s l e l i n ) 瓤玉卷啜to s 扣妇d力∥”球棚凰) 幼虫的生物活性测定；并克隆得劐B t 4 lt 扣v 加触的基因片段本磅究建立了P c R * R F L P 的方法，筛选v 弘珏基因j 魄方法根据五种v 枷谢基因的保守区设计一对通用S f 物，丽来扩增v 秘列基因的l ，4 5 6b p s 的基因片段，此片段经胁，，d I J J 和点亡D Rl 双酶切后，电泳捡测酶切条荣大小，根掇电泳图谱，确定基因类型。

通过北方法，从签定懿6 0 6 株B t 替株中有3 8 2 株得到v 扫蒯基函扩增产物，约占总数的6 3 ％，说明v 啦荆基因的分布广泛根据酶切电泳显示，共有三种R F L P 图谱，3 1 5 株含有与已知v 护3 爿群』楣同的电泳匿谱( 8 6 0 ，2 6 0 ，1 9 0 和1 6 0b p s ) ，另外发埂嚣弛藜的R F ￡磐图谱与已知5 种基因不霹，其中5 2 株( 含麓株B t A L ) 静惫泳图谱箍示8 6 0 ，2 醐，1 6 0 ，1 5 0 b p s 条带；l5 株( 仑菌椿B t 4 1 ) 的电泳图谱显示l ，1 0 0 ，1 9 0 和1 6 0b D s ，均不同于其他已知v 细捌的R F L P 图谱 对含有新嘲烈基因的B l A L 菌株屡粒D N A 进行c ∥帮v 秘蒯基因鉴定，发现其 台奄汀v j 矗b ，c w i C a ，州j c b ，c H i 硒，c 搿i B d ，c w l 珞，c r v 2 A b ，州9 翰耨颓艇v { p 3 A基因以B n L 菌株质粒D N A 为模板扩增锝到2 ．3 7k bv 珈弘基因产物，撼入到表达 载体p E 豫1 b 上，褥到熏组质粒p 8 v 簪，宠成宠隆移测廖，并将穿刭提交G e n 转a 呔登记，A c c e s 《o nn u m b e r 为D Q 2 4 1 6 7 4 ，嚣船f 帮鄹捕“r 懈沱瑚商杀虫晶体蛋囱命名委员会命名为v i p 3 A a l 9 。

序捌分析表明V i p 3 A a l 9 蛋自由7 8 9 个氨基酸组成，分予量为8 8 ，7k D a ，该蛋白等电点为p H 5 ．1 7 ，为弱羧性蛋自与所有的v i p 3 类蛋| 皇作了网源关系分柝，此蛋白与融知v i p 3 A a { 2 共有最高为9 7 ．6 ％酌序确同源往，存在1 9 个氨基酸残基的不同将含有p B v j p 质粒的大肠杆菌在O ．7m m o l ／LI P T G ，1 8 ℃，1 3 0f ／m i n 条停下，诱导表达1 8 小对，提取表达产物，s D s ．P A I l 3 匿分极表明v 秘3 9 搿j 9 基因程置∞露中表达蛋自为可溶的生物活性测定表晴表达产物对甜菜夜蛾幼虫其有显著酌杀虫活髋，L c 5 0 为1 ．4 3n ∥m g 饲料；对棉铃虫和小菜蛾幼虫也具有显著的系虫活性，L c 5 0分别为2 4 ．1 4n ∥m g 饲料期5 9 + 8 2 牡g ，m L ；但此蛋自慰玉米蜞淫蛙不寒，K 5 大予l ∞ 毡幽L ，只具存一定的体重抑制作翔对含有新v 秘纳基因的B t 4 l 菌株质粒E I N A 进行c 砂和v 弘妇基因鉴定，发现菌株B t 4 l 禽商c w J 爿爿，e 拶J C 毋，c ∥蛆} 秘一耪毅型v i p ．弘基因。

并从B 描l 菌株中竟隆得到了v ≯弘的基豳片段{ ，4 S 6b p 嚣，溅序结果显示其蛋自序猁与已l 知V j p 3 A f l 其有8 3 ％的序列同源往在G e n B a n k 登记，A c c e s s i o nn 啪b e r 为D Q 2 5 0 2 5 6 ． 本研究发现了两种新的v 功鲥新摹西，完成了v 弘谢d ，_ 9 基因的克隆及活性测定，确定了对鳞翅强鼹虫烈菜瘦峨的寒毒力由于爨藻夜蛾是一类危害极其严羹、抗性上毒舞较狳翁毽秀毽害虫，慈瑰鸯豹B l 产熬难该类害塞瓣匿闯防效较嚣，赝敷，照纂因戆发蠖对于稳菜疲滚嚣茨滚翼毒耋簧焱义荚键词：苏云金芽孢争于菌；营养期恭窳鬃囱；甜菜夜蛾；，j 、菜蛾；v i p 3 A a l 9i d e n t i f i c 锺t i 蛐，c l o n i n ga n d 删V i | i e so f 咄泌g c n e sf r o 硼踟e 鳓s 珐嚣嘲妇s 螽A m h o r ：j i n h u a n 乙i uS u p e r v i s o r ：A s s o c i 如P r o f ．J i 粕x 遮慨，A s s o e { 蹴p 娥F 坤豫S 鳓gM a j o r ：M i c r o b i o j o g yA b s n Ⅷc t确ev 驷削* g e n et y p e si nt h e 舶c 讲淞折“r 嘲妇琳豇( B t ．) s t r a i n sw e f es c r e e n e db yn s i 耀P C R I R F L P ( p o l y m ￡捻s e 陡a i nr e a e t i o n - r e 髓r i c { i b n 晌g m e n t1 e n g t hp 0 1 y m o 啦i s m ) m e t l l o d ．W ÷i d e n t 湎e dt h e ∞7a n dV 毋副g e n et y p e so fs t r a i n sB t A L8 聪B t 4 l ，弧ep 弘联g e 黼法 B t A 毛啪sc l o n 酣，e x p r e s s e 娃a n di 拈t o x i c 酊t o 酗D 痂∥P 加船j g 枷，胁玩o w 伊n 棚行啦阳， j 吖删g ，撕咖抛抛a n d ( b 妒加如乒f r 舡球。

d ，虹警姑r es t u d i e d ．w eo b t a i 狂e d _ l ，自心■鐾e 砖e { 珏g m e n ￡o f B t 4 1 ．P c R —R F L PW a su s e dt of a p i d l yi d e n 鼍i f y 踟o f 踟5 珐甜r ≠裙f e 璐嚣s t 糟i n sh 赫o r i n gh ㈣lo rn o w lv ≯3 ■一t y p eg e n e s ．Ap a i ro fu n i v e r s a lp r i m e f sw a sd e s i g n e db 袅s e do ne o n s 蹦v e dr e g i o n so f 蠡v e 却．；_ g e n e s ．A m p l i 瘀e d 湖d u e t s ( 1 ，4 5 6b p s ) d i g e s t e dw i t hl h e 手抒H d l l Ia n d凰口RIe I l z y m e sw e r er u no na g a r o s eg e l ss oa st oc o 蝴雕d i f & r e n t 艘L Pp a 搬限s ＆ru s e d 协i d 锄t i 移V 缸跏一t y p eg 鞠e so f 最髓耵砸膨瑚括s t r a i n s ．T h eV 勿鲥g e n e —t y p e so f6 0 6最f 厶”r 媳妇燃拇s t f a 蕊㈣r es c f e e H e da n dl h f e ep a 圭t e m so f 灯L Pw e f es 鞋c c e s s 矧yi d e n t 涵e d ．At o t a lo f 3 S 2s t r a i n sh a r b o r e dv 多捌g e n e s ，b a s e do nap o s i t i V eP C Rs i g n a l ，删也e 聪烈l t si n d i e 艇e dt h a ll kv 扣鲥g e 娃eh a daw 谄ef a n g eo fd i s 蜥h l t i o n ．0 ft h e s es 仃a i n s ，a g a m s eg e ld a t ac o n n m e d315i S o i a t e sb a dav 勿鲥辟t y p eR F L pp a n e 趣( 8 6 0 ，2 6 0 ，1 9 0鞣d ! 鳓坤s ) ，e 黼f o 黼{ n 蠡t o 氆ep r e d i c t e d 蠢a 辨e n t so fV 渊口7 一t y p eg e n e s ．5 2s t r a i n s ，i n c l u d i n gs t r a i nB t A Ls h o w e dan o V e lv f 妒蠢- t y p eR F L Pp a 挂e m ( 8 6 0 ，2 6 侥l6 0 ，l5 0b 弘a n dm o r es h o r t e r 衲g m e n t s ) ．As e c o n dn o v e lv 驷翩一妙p ep a t t e m ( 1 ，l O O ，1 9 0a 1 1 d1 6 0b p s )w a sa l s oi d e n t i f i e d 速l5 { s o l 毅e si n e l u d i n g 最珐封r f 耀撂掰矗B 礴1 ．w ef 曲n dt h a ts t r a i nB 认Lc o n t a i n i n gc 掣似槐∞，，o ，c 秒，∞，咄J 鼬，c ∥掳醴c 秒J 然 e f 删致e 拶她6a 珏dn 错l ev 缸澍g e n e s { h f o u g l li d e m i 蠡i n gf 矽a 1 1 dV ≯鲥g e n et y p e so fp l a s m i dE 瞳q Ao fB t A L ．A2 ．3 7 k bV 本^ 王4l 弦n eP e Rp f o d t l c t 、垤sa ￡n p l i §e dw i t hp 1 8 s m i d D N Ao f B t A La s { e m p l a t e ．I tw a si n ∞r t e di n t oav e e t o rp E T - 2 1 b ．1 1 1 en u c l e o t i d es e q u e n c ed a t ao fV i p 3 A a l9w e f ea s s i g n e dG e 致B a 芏波筑c e e s s 呈o nn H m b e r sD ( 配4 1 6 7 4 ．s e q 韬e n e ea n 稿v s e ss h o w e d 也a tv 细j 一蹿，9p r o t e i nc o n s i s l e do f7 8 9r e s i d u e so fa I I l i n oa c i d sw i map r e d i c 托d 拜l o l e c u l 嚣∽i 曲to f8 8 ．7k D aa n 鑫i s o e l e c 嘶cp o。