蛋白相互作用.doc

一、技术简介    BiFC是由Hu 等在2002 年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术[1]. 有报道在GFP 的两个β片层之间的环结构（loop）上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响GFP的荧光活性，BiFC技术正是利用该荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发出荧光在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有重要意义    其后发展出的多色荧光互补技(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.这项技术不需要特殊的设备，相互作用的蛋白也不需要特别的理论配比因此，BiFC技术已被国际上众多实验室采用，在活细胞内证明蛋白质的相互作用。

    BiFC技术以下几个特点使其对于研究蛋白质相互作用具有独特的优势：    1、能在显微镜下直接观察到蛋白相互作用而且不依赖于其它次级效应；    2、该相互作用可以在活细胞中进行观察，排除了由于细胞裂解或固定可能带来的假阳性结果；    3、蛋白质在近似生理条件的环境下表达，表达水平及特性如翻译后修饰极大地接近于内源蛋白；    4、不需要蛋白质有特别的理论配比，能检测到不同亚群蛋白质间的相互作用；    5、多色BiFC技术不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较；    6、BiFC技术除了荧光倒置显微镜外，不要求特殊的设备    实验简单、快捷、直观，并适用于原核、真菌、植物、动物等多种组织、细胞. 该技术的完善与发展必然会为蛋白质组学、蛋白质相互作用连锁图的建立带来福音. 但是，该技术与大多检测蛋白质相互作用的技术一样，也存在着假阴性和假阳性的问题，需要在实验中仔细验证可参考文献：    Hu, C.D., Y. Chinenov, and T.K. Kerppola, Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell, 2002. 9(4): p. 789-98.       Hu CD , Kerppola TK. Simultaneous visualization of multiple protein  interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation  analysis[J ] . Nature Biotechnology , 2003 ,21 (5) :539 - 545.【摘要】  双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）是指两个不发光的荧光蛋白互补片段在与其融合的蛋白质的相互作用驱动下重新组装形成荧光复合物，恢复荧光特性。

基于双分子荧光互补原理的相关技术在多种不同类型的蛋白质相互作用研究中得到越来越广泛的应用我们对双分子荧光互补技术的原理、特性、应用现状、面临的问题及应用前景进行了概述 【关键词】  双分子荧光互补（BiFC）；互补片段；荧光复合物；蛋白质相互作用 Advances of Bimolecular Fluorescence Complementation Assays    and its Application in the Study of Protein-protein InteractionsCHEN Jing    (State Key Laboratory of Trauma,Burn and Combined Injury, Department of Research Institute    of Surgery, Third Military Medical University，Chongqing 400042，China)    Abstract：Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) means two non-fluorescent complementary fragments of fluorescent protein can reassemble to form fluorescent complex and restore fluorescence when they are fused to two proteins that interact with each other. BiFC analysis has been used to study interactions among a wide range of proteins in many cell types. In this paper, the principle and characteristics of BiFC，the application advances, the limitation and future prospects of BiFC assays are described.    Key words：Bimolecular fluorescence complementation(BiFC)；Complementary fragments；Fluorescent complex；Protein-protein interactions    1  引  言    蛋白质相互作用和翻译后修饰的研究使人们对生物调控机制的认识取得了巨大的进展，蛋白质相互作用的研究方法也备受重视，出现了许多具有不同原理和应用特点的相关技术和方法［1-2］。

BiFC作为一种用于研究蛋白质间相互作用的新型方法引起了人们的关注利用BiFC分析能够在活细胞生理环境中原位显示蛋白质相互作用产物，尤其是能在单细胞中同时显示多个蛋白质间的相互作用近年来，基于BiFC原理的分析方法在蛋白质相互作用和翻译后修饰的研究中逐渐显现出其独特的应用价值    2  BiFC概述    2.1  BiFC原理    　　GFP及其突变体作为能够在活体中表达且易于检测的报告基因［3］，通常是以完整的氨基酸序列作为标记物随着对其结构和功能研究的日益深入，不断发掘一些新的特点，如GFP基酸序列中的某些特定位点与氨基末端以及羧基末端之间的序列循环互换后仍然能够正确折叠形成生色团结构并保持荧光特性［4-5］Hu CD等通过进一步研究发现［6］，在GFP及其突变体氨基酸序列的155或173位点，将其分裂为均不具备发光性能的荧光蛋白片段，即氨基末端片段（含1-154或1-172氨基酸序列）和羧基末端片段（含155-238或173-238氨基酸序列），当某些特定的氨基末端片段与羧基末端片段组合作为标记分子分别与两个能够发生相互作用的蛋白质配偶体形成融合蛋白、并同时在活细胞中表达时，蛋白质配偶体的结合驱使氨基末端片段与羧基末端片段重新组装形成荧光复合物，恢复荧光效应［6-7］。

这一现象称为双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC），能产生BiFC效应的氨基末端片段与羧基末端片段称为互补片段　　 2.2  BiFC的特性    2.2.1  荧光蛋白片段的互补特性  按照不同的分裂位点，每个荧光蛋白可产生两个氨基末端片段和两个羧基末端片段，分别以N155、N173和C155、C173表示BiFC可发生于同一荧光蛋白的氨基末端片段与羧基末端片段之间，如EYFP的N155和C155、N173和C173，也能发生于不同荧光蛋白的氨基末端片段与羧基末端片段之间，如GFP的N173和EYFP的C173、EYFP的N173和ECFP的C155某些荧光蛋白片段具有多重互补特性，能够与两种以上其它片段互补，如EYFP的N173能够与EYFP的C173、C155和ECFP的C155形成荧光复合物但并非所有的荧光蛋白的氨基末端片段与羧基末端片段之间都能产生互补，至今尚未观察到GFP的氨基末端片段与羧基末端片段能形成荧光复合物［8］    2.2.2  BiFC的光谱特性  荧光蛋白的三肽生色团结构（65-67位氨基酸）位于氨基末端片段内，双分子荧光复合物的光谱特性主要取决于氨基末端片段。

来源于同一荧光蛋白的互补片段形成的荧光复合物的激发光谱和发射光谱与对应的完整的荧光蛋白光谱一致，在某些情况下有红移现象发生，这可能与互补片段组装过程中生色团周围的氨基酸排列产生一定改变有关［9］来源于不同荧光蛋白的互补片段形成的双分子荧光复合物的激发光谱和发射光谱介于其来源的两种荧光蛋白光谱之间，与氨基末端片段来源的荧光蛋白光谱接近总之，相对于天然荧光蛋白，双分子荧光复合物的荧光强度有不同程度的减弱    2.3  互补片段的研究进展    　　自BiFC发现以来，最早确认的12种互补片段组合来源于EGFP、EYFP、ECFP［7］，分属7个不同的光谱类型这些互补片段标记的融合蛋白载体转染细胞并稳定表达后，必须在低温下（30℃）预孵化0～24 h以促进互补片段组装形成的生色团成熟为克服低温引起的应激刺激的影响，科学家们不断寻找新的性能优异的荧光蛋白互补片段现已证实YFP的两个新的突变体Citrine和Venus以及ECFP的改进型荧光蛋白Cerulean，其氨基末端片段与羧基末端片段的所有组合均能在37℃ 生理培养条件下产生荧光互补［8］，这不仅明显缩短了反应时间，使形成的双分子荧光复合物的荧光强度提高2倍以上，并且需要转染的质粒数量也大大减少。

在已经发现的互补片段组合中，目前认为最有效、并推荐使用的互补片段组合及其光谱特点［10］见表1 表1  推荐使用的互补荧光片段组合    3  BiFC的应用特点    　　基于BiFC的原理和互补片段的特性，BiFC技术的应用具有如下特点：    (1)在活细胞生理环境中直接、原位显示蛋白质相互作用产物    (2)不同的双分子荧光复合物之间的光谱差异能够满足以不同的颜色在同一细胞中同时显示多种蛋白质间相互作用的需要    （3）BiFC分析适用于可形成二聚体或共价结合的蛋白质间的相互作用, 包括肽、核内蛋白、泛素家族蛋白、信号蛋白、酶复合物、膜蛋白、核酸结合蛋白、植物蛋白、植物病原体能鉴定新的蛋白质间的相互作用而无需了解其相互作用有关结构基础的先验知识    （4）荧光蛋白片段与待检蛋白构成的融合蛋白在哺乳动物细胞、植物、微生物中都获得了成功的表达    （5）双分子荧光复合物的形成不需要外加底物和辅助因子，使蛋白质相互作用的检测对细胞的干扰降低到最小程度    （6）BiFC具有的灵敏度足以检测与内源性表达水平相当的蛋白质间的相互作用，从而使实验结果更真实地反映天然蛋白的特性    （7）除普通荧光显微镜外，利用BiFC进行蛋白质相互作用分析不需要特殊仪器，实验结果也不需要进行复杂的数据处理或荧光校正。

    4  BiFC的应用现状    4.1  用于蛋白质相互作用的亚细胞定位    　　不同蛋白质。