神经肌肉组织活检常用方法和步骤.pdf

肌肉活检样品取材和送检注意事项 一般原则 1. 通常使用活组织切开检查法获取肌肉组织; 2. 对于具有不协调病理学功能障碍患者,切开活组织检查非常必要,例如多发性肌炎; 3. 烧伤、缝合或磁夹部位的肌肉组织不能取样送检; 4. 细针穿刺肌肉组织活检可以减少病人的损伤,但也可能会取样不全,丢失肌肉斑片或肌外膜组织; 5. 尽可能在同一活检取材位置获取数个肌肉样品,特别是对于多病灶疾病,炎性肌病,需要做代谢分析的肌病可疑患者; 肌肉样品送检 1. 肌肉样品在湿盐水纱布中可保存几个小时,注意肌肉不应该浸在盐水、固定剂或其他液体中,同时样品须存放于凉爽处; 2. 样品不能及时送检时可用充足的干冰保存过夜; 肌肉样品冷冻与保存 1. 样品经异戊烷予冷器处理冷冻在-160℃液氮中,也可使用丙酮和干冰的混合液冷冻,肌肉冷冻后最好密封贮存在-70℃,防止酶活性和水分丢失,肌肉样品在液氮或-70℃冰箱中可长期保存; 2. 经上面方法处理的标本肌肉纤维形态好,光镜检查时可获得大多数诊断信息; 3. 为了避免人为现象,送检样品冷冻处理时应该迅速 电镜样品固定 1. 部分样品固定于 4%戊二醛,固定的肌肉组织多用塑料包埋剂包埋; 2. 电镜分析可以很清楚显现肌膜毛细血管; 石蜡包埋材料 1. 石蜡包埋的材料有利于炎症和炎细胞形态观察,但是石蜡切片肌纤维的形态较差; 2. 福尔马林固定、石蜡包埋切片无法进行对于某些组织化学和免疫组织化学染色,因此为了满足诊断需要,多数肌肉活检样品需要立即进行冷冻保存或新鲜标本送检; 3. 需要石蜡包埋切片的标本应用福尔马林固定; 病理实验室肌肉活检样品常规处理方法 骨骼肌活检,应尽量避免出现人为现象;根据检查的目的进行必要的处理;标本处理原则上要满足组织化学、电镜和生物化学检查的要求;例如,线粒体异常需要另外保留分离线粒体的样品;如果需要做去皮纤维 skinned fiber 或破膜纤维检查,需要将标本保存在缓冲液中; 组织化学检查 活检的肌肉标本要用生理盐水浸湿的纱布包裹,放入玻璃瓶内,纱布应该稍微挤干些,避免水分过多,水分过多容易肌肉膨胀;样品直接暴露在空气中很容易干燥;干燥的样品肯定会出现人为现象,影响制片和诊断;操作过程中尽量避免产生人为现象; 一般活检的肌肉组织直径 5mm,长度 1cm 左右,固定于软木塞上;软木塞可选用小瓶塞直径 1～将肌肉组织竖立在软木塞上,用托辣甘树胶黄蓍树胶直立固定肌肉,切片时使呈横断面;注意不要将肌肉完全包埋在黄蓍树胶中; 肌肉组织需要骤冷冷冻,不然会产生冰晶;肌肉组织的细胞比较大,特别容易产生冰晶;含有冰晶的肌肉组织染色后细胞内会出现大小不等的空泡;为了快速冷冻,一般使用液氮-160℃,丙酮、 干冰混合液-90℃;如果将组织直接放入液氮内组织周围产生大量的汽化液泡,产生热隔断效应,会延迟冷冻速度;所以现在的方法是先将产生气泡较少的异戊烷冷却于液氮中,再将组织放在充分冷却的异戊烷中进行冻结; 100ml烧杯在颈部系上牵绳,往烧杯中加60～70ml异戊烷,将烧杯轻轻放入液氮中;为了使异戊烷冷却均匀,用搅拌棒或镊子不断搅拌异戊烷,开始时液氮因激烈汽化而冒出白烟,而后逐渐减少;异戊烷充分冷却后,在烧杯中产生白色结晶; 用大镊子夹住软木塞,迅速置入异戊烷中,迅速左右轻柔地晃动;托辣甘树胶粘附固定肌肉目的就是在充分冷却的异戊烷中轻柔细微地晃动;如果将组织静置在异戊烷中,组织周围异戊烷的温度升高,包裹在组织周围,不能迅速彻底冻结,组织容易形成冰晶,组织轻微晃动冷冻液充分流动,使组织迅速冻结,很难形成冰晶;在异戊烷中冷冻 20-30 秒钟;移入放有干冰的箱中,放置 1 小时,使组织周围的异戊烷挥发干净;放入能密封的塑料袋或玻璃瓶中避免组织干燥,置-70℃冰箱中保存;-70℃以下密封保存最少可保存 1 年,不会影响组织化学检查结果;我们观察保存 10 年以上的标本,染色后的效果和新鲜组织没有明显差别; 恒温冷冻切片冷冻切片机内部的温度-25～-20℃为宜;低于-25℃时,肌肉过硬,容易出现横皱,高于-20℃时含脂肪、结缔组织的肌肉伸展不良;容易出现皱褶现象;最好在载玻片粘贴2～3 行连续切片的组织; 冰冻切片室温保存2～3天进行任何染色都不会使活性降低,但室温保存5天以上,ATPase染色或 Phosphoryase 磷酸化酶染色效果较差;另外,改良 Gomori 染色法最好在切片当天进行; 肌肉组织活检冷冻步骤 用品 1. 液氮 2. 异戊烷 Isopentane 2 methyl butane 3. 长把手镊子 4. 两个金属容器 5. 手套 6. 一次性软木塞 安全与防护 注意：异戊烷非常易燃,不要让该材料到达室温,放入液氮时使用防护眼镜; 试剂配制 7%托辣甘树胶 Gum Tragacanth 托辣甘树胶 7g 蒸馏水 100ml 麝香草酚 5 粒 托辣甘树胶加入蒸馏水中溶解,再加入 5 粒麝香草酚,室温搅拌; 注：托辣甘树胶非常难溶解,溶液可放在室温间断搅拌;配制后 4℃保存,保质期 6 个月;口香糖的主要成分为托辣甘树胶,口香糖用开水或温水浸泡 5min,然后再用蒸馏水几次,用清洗后的口香糖代替托辣甘树胶使用,用于粘附固定组织效果并不受影响;口香糖的使用方法仅本人试用,主要顾虑是否会影响 PAS 染色,口香糖的使用需要更多的实践检验; 肌肉冷冻步骤 1． 放适当量的托辣甘树胶于软木塞上,将病人姓名和病理编号写到软木塞或贮存肌肉样品的容器上; 2． 将肌肉组织放在托辣甘树胶中肌肉组织需要暴露 1/3 或 1/2 托辣甘树胶之上,不要完全埋到托辣甘树胶中;肌肉埋入的方向垂直,肌丝横断面向上切片为横断面; 3． 准备一个 100ml 小烧杯装入 60～70ml 异戊烷,用规格为 700mm 的滤纸包住小烧杯的口,再用橡皮筋扎住小烧杯周边的滤纸小心放入液氮中,不要将异戊烷浸到液氮中,让异戊烷降到-140℃,异戊烷下面冻成固体上面呈液态时即可开始冷冻; 4． 用长镊子夹住软木塞将准备好的肌肉组织朝下浸到异戊烷中迅速冷冻,并在异戊烷中轻轻地晃动 10 秒左右,加快冷冻速度,避免形成冰晶; 5． 用镊子夹住软木塞不动维持 20 秒钟,较小于 0.3cm 的组织 5 秒钟冷冻过程中不要将肌肉组织离开异戊烷,直到组织冷冻完成; 6． 小心将冷冻的组织包埋块拿出来,迅速放入预冷的容器中密封贮存或及时做冰冻切片;或在-70℃以下无限期保存; 7． 冷冻后的异戊烷回收到原容器中,盖紧瓶盖,4℃冰箱储存,冷冻肌肉组织的异戊烷可以反复使用,并不影响冷冻效果;异戊烷易挥发,易燃,使用是应注意; 冰冻切片操作步骤 1. 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净,需经常用毛笔或柔软的纸张清除残余组织碎片;必要时每切完一张切片后就用纸擦一次;因为切片时组织很容易附贴在防卷板和切片刀之间,如果有残余的包埋剂粘附切片刀或放卷板上,切片容易出现皱折,或组织片断裂,很难获得完整的切片; 2. 如果几个病例同时做冰冻切片,应将组织分别放于不同的支承器上,放到冷冻台上冷冻,然后跟据不同病例的编号,按顺序进行切片,并在切片上标记该组织的编号;防止张冠李戴;良好的工作习惯,周到的工作计划,能够有效提高工作效率,使工作忙而不乱; 3. 切片时发现组织冷冻过度,可将冰冻包埋的组织块连同支承器取出来,在室温停留片刻,或者用大拇指按压组织块,以此来软化组织,还可以把冷冻温度点稍微升高一点;来缓解冷冻过度的程度,让组织尽快达到合适的切片温度; 4. 用于附贴冰冻切片的载玻片,室温下应用,不必放入冷藏或冷冻;因为附贴切片时,室温下的载玻片与冷冻箱中的切片有一定的温差,当温度较高的载玻片与温度较低切片接触时,冰冻切片很容易贴到载玻片上;而冷藏或冷冻过的载玻片就不容易贴牢,需要提高温度才能贴牢;切片附贴时容易产生气泡; 5. 肌肉活检 Gomori 三色和改良还原型辅酶Ⅰ四唑蓝还原酶染色法组织切片不需要固定;其余染色方法根据所这证实的组织成分选用最佳固定液固定; 肌肉活检样品的染色方法 改良还原型辅酶 I 四唑蓝还原酶 NADH-TR 氧化酶组织化学染色法 固定：不需要固定 切片：冰冻切片 10um 试剂配制： 染色液 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NADH-Sigma N8129 8mg 硝基四唑氮蓝 Nitro blue tetraolium-Sigma N6876 10mg Tris HCl 缓冲液 10ml 二甲亚砜 DMSO ～1ml 以上试剂临用前新鲜配制,配制方法将 NNADH,NBT,Tris-Hcl 混合后加入 DMSO 然后用玻璃棒搅拌 2～3 分钟,过滤后使用; 根据上面配方我们在应用时进行了一点变通下面是我们采用的配制方法： A 液 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NADH-Sigma N8129 8mg Tris HCl 缓冲液 5ml 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NADH 溶解于 Tris HCl 缓冲液中; B 液 硝基四唑氮蓝 Nitro blue tetraolium-Sigma N6876 10mg Tris HCl 缓冲液 5ml 硝基四唑氮蓝 Nitro blue tetraolium 溶解于 Tris HCl 缓冲液中; C 液 二甲亚砜 DMSO 10ul A液和B液分别分装到EP管中,每管50ul,-20℃储存;临用时室温解冻, A液50ul和B液50ul混合再加入 C 液 10ul;可以染 1～2 张肌肉组织冰冻切片;长期 6 个月-20℃储存染色不会产生任 何 影 响 ; 这 种 变 通 可 以 免 去 每 次 染 色 前 称 量 繁 琐 过程; 染色步骤 1. 冰冻切片放入湿盒中滴加染色液置 37℃恒温箱 10～20mins; 2. 流水冲洗 1min; 3. 蒸馏水洗 3 次; 4. 甘油-明胶封片; 结果：基质网和线粒体呈紫蓝色,Ⅰ型肌纤维比Ⅱ型肌纤维颜色黑些,血管壁同时也被染色; GOMORI 三色法染色步骤 原理 Gomori's一步三色法是原生质染料铬变素2R与结缔纤维固绿FCF在钨酸液中加入了冰醋酸一种联合染色 样品要求 迅速冷冻人横纹肌利用前面提到的异戊烷冷冻法 方法 固定 不需要,使用速冻的组织 技术方法 速冻的组织经恒温冷冻切片机上切10～16微米,附贴于盖玻片或载玻片上,按需要决定切片数量; 设备品 ① 染色架 ② 染色碟 ③ 染色缸 ④ 镊子 ⑤ 乳胶手套 试剂 1. 冰醋酸Glacial Acetic Acid -Fisher A507-500, CORROSIVE store at room emperature; 2. 铬变素2RChromotrope 2R - Sigma C3143, IRRITANT, store at room temperature; 3. 去离子水; 4. 固绿FCFFast Green FCF - certified, Sigma F7258,GLOVES AND MASK REQUIRED, store at room temperature 5. Harris苏木精染液 6. Permount - Fisher SP15-100, FLAMMABLE HEALTH HAZARD 7. 磷钨酸 游离酸- Sigma P4006, CORROSIVE, store at room temperature 8. 乙醇 9. 二甲苯 溶液 1. Gomori's trichrome stain 铬变素2R 0.6g 固绿FCF 0.3g 磷钨酸 0.6g 去离子水 100ml 冰醋酸 使用1N氢氧化钠调pH至,室温保存,液体1周内有效; 2. %冰醋酸 去离子水 100ml 冰醋酸 3. 50%乙醇 乙醇 50 ml 蒸馏水 50 ml 4. 70%乙醇 乙醇 70 ml 蒸馏水 30 ml 5. 80%乙醇 乙醇 80 ml 蒸馏水 20 ml 6. 950%乙醇 乙醇 95 ml 蒸馏水 5 ml 染色步骤Staining Procedure 1 将切片插入染色架上 2 Harris苏木精染5min 3 自来水冲洗min 4 Gomri 三色液染色10min 5 %醋酸浸几次要充分分化 6 直接用95%乙醇洗 7 继续用上行乙醇液95%×2,100%×2脱水 8 二甲苯透明3～4× 9 中性树胶封固,并标记切片 结果 细胞核 红色-紫红 正常肌肉肌原纤维具有不同的绿色A和I折射带 Itermyofibrillar muscle membranes: Red 间质胶原 绿色 改良 Gormori 三色染色法 此染色法对线粒体肌病和先天性肌病的诊断非常有价值; Gormori’s 液 A 液 变色酸 2R 0.6g 固绿 FCF 0.3g 磷钨酸 0.6g 冰醋酸 1ml 蒸馏水 99ml 用 1M 氢氧化钠调 B 液 冰醋酸 蒸馏水 100ml 组织样品 肌肉组织经防冰晶处理后,冰冻切片不固定,切片 5-10 微米,肌纤维横切; 染色步骤 1. 冰冻切片,室温下晾干切片; 2. 用 Harri’s 苏木精染 5mins; 3. 蒸馏水洗; 4. 切片放入 A 液中染 10mins; 5. 用 B 液冲洗切片几秒钟; 6. 乙醇脱水; 7. 二甲苯透明,树胶封固; 结果： 核 蓝色 Ⅰ型肌纤维 绿色带有红色 Ⅱ型肌纤维 绿色 说明： 1. 两型肌纤维都是绿色,但Ⅰ型肌纤维含有更多红染色颗粒物质而带有红颜色; 2. 此方法是一种改良 Gormori 三色染色法;  PASPeriodic Acid Schiff 染色方法 简述：该方法用于福尔马林固定石蜡包埋切片的肝、心脏和骨骼肌组织中的糖原检测,还可以用于冰冻切片,糖原,粘液和真菌被染成紫色细胞核被染成蓝色; 固定：10%福尔马林; 切片：石蜡 5 微米 试剂配制： 1. %过碘酸水溶液 过碘酸 0.5g 蒸馏水 100ml 2. Schiff 试剂 碱性复红 CI42500 6g 蒸馏水 1200ml N 盐酸 60ml 偏重亚硫酸氢钠 12g 用 600ml 蒸馏水溶解 6g 碱性复红,煮沸几分钟,冷却到 50℃加入 60ml N 盐酸,冷却到25℃加入 12g 偏重亚硫酸氢钠高纯度化学试剂;液体放于暗处 24 小时;24 小时后加 5～6g 活性炭,摇动大约 1 分钟; 通过粗过滤纸过滤,液体应该清亮,如果液体有颜色重复加入活性炭; 最后补充蒸馏水至液体到总量 600ml,放入棕色瓶中冰箱内保存; Schiff’s 试剂质量测试： 量 10 毫升 37%甲醛倒入透明小玻璃瓶中,加几滴 Schiff 试剂测试,质量好的 Schiff 试剂会立刻变成紫红色;质量不好的 Schiff 试剂会延长反应,而且颜色畸形伸长会变深呈蓝-紫色; 另外,用水测试,把 Schiff 试剂直接滴入水中,立即出现洋红色说明试剂质量很好,出现粉红色或无色,说明质量不合格或过期,应该从新配制; Schiff 试剂保存： 常规棕色瓶内贮存,冰箱内4℃保存;这种条件下保存的 Schiff 试剂最长有效时间不超过 1年;有些有效期更短,3 个月,甚至 1～2 个月;具有关资料介绍 Schiff 试剂配制后进行分装冷冻保存可以延长试剂的有效时间;融化后使用,染色效果和新配制的 Schiff 试剂比较没有区别;可以保存数年,本人使用过冷冻贮存 4 年以上的 Schiff’s 试剂,并不影响染色结果; 3. Mayer’s 苏木精液 PAS 染色步骤 1. 切片脱蜡至水; 2. %过碘酸氧化 5 分钟; 3. 蒸馏水冲洗; 4. Schiff’s 试剂染 15 分钟切片变为粉红色; 5. 自来水冲洗 5 分钟;切片变成深红色; 6. Mayer’s 苏木精染 1 分钟; 7. 自来水冲洗 5 分钟; 8. 95%乙醇,100%乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固; 结果：糖原,粘液和基底膜-红色/粉红色.,背景-蓝色; PAS/D-糖原淀粉酶消化染色法 简述：α-淀粉酶是一种消化酶,唾液中含有淀粉酶; 对照：相同的组织块上切两张切片;一张消化另一张不消化;然后两张切片都用 PAS 染色;肝脏是最好的对照组织; 试剂配制： 1. 消化液 淀粉酶用α-淀粉酶 0.05g 蒸馏水 50ml 首先Sigma产品α-淀粉酶 VI-B 产品号A3176;用蒸馏水慢慢溶解酶;新鲜配制,15分钟内使用,用后丢弃; 2. %过碘酸 过碘酸 2.5g 蒸馏水 500ml 3. Schiff’s 试剂 碱性复红 CI42500 6g 蒸馏水 1200ml N 盐酸 60ml 偏重亚硫酸氢钠 12g 用 600ml 蒸馏水溶解 6g 碱性复红,煮沸几分钟,冷却到 50℃加入 60ml N 盐酸,冷却到25℃加入 12g 偏重亚硫酸氢钠高纯度化学试剂;液体放于暗处 24 小时;24 小时后加 5～6g 活性炭,摇动大约 1 分钟; 通过粗过滤纸过滤,液体应该清亮,如果液体有颜色重复加入活性炭; 最后补充蒸馏水至液体到总量 600ml,放入棕色瓶中冰箱内保存; 染色步骤 1. 石蜡切片脱蜡至蒸馏水; 2. 用微波炉加热淀粉酶液 20 秒; 3. 放标记消化切片用加热的淀粉酶液消化 15 分钟,不要过度化消; 4. 自来水冲洗,蒸馏水洗; 5. 两种切片同时按 PAS 步骤染色; 结果： 未经淀粉酶消化的切片糖原被 PAS 染成洋红色,经淀粉酶消化的切片消失; 说明：如果切片消化过度,组织需要重切;消化过度有花边现象,甚至没有组织留下; Highman’s 刚果红染色法 Highman 1946 这是一种简便、广泛被应用的染色方法;染液的稳定性相当好;该方法经有经验的老手选择提供;资料来源组织学技术 Theory and Practice of Histological Techniques 第六版; 固定：不关键；福尔马林盐能获得满意的结果; 试剂配制： 1. %刚果红溶液刚果红溶解于 50%乙醇 100ml; 2. %氢氧化钾液氢氧化钾溶解于 80%乙醇 100ml; 染色步骤 1. 切片脱蜡至水,必要时祛除色素; 2. 刚果红液染 5 分钟; 3. %氢氧化钾液分化 3～10 秒; 4. 水洗,明矾苏木精染核,分化,返蓝; 5. 脱水,透明,封固; 结果：淀粉,弹力纤维,噬伊红颗粒-红色; 核 -蓝色; 说明：第 3 步分化,可以用水终止,分化过度可能会发生,如果必要可以重复; PTAH 染色法 Shum&Hon 1969 A 液 苏木精 0.8g 蒸馏水 1ml 0.8g 苏木精加 1ml 蒸馏水研磨成糊状,糊状液体应该呈巧克力颜色,颜色淡的通常是指示剂不适合此方法染色,应该丢弃; B 液 磷钨酸 0.9g 蒸馏水 9ml A 液和 B 液混合,煮沸,冷却后过滤; 染色步骤 1. 切片脱蜡至水; 2. 酸性高锰酸钾处理 5 分钟; 3. 自来水冲洗; 4. 5%草酸水溶液漂白; 5. 充分自来水洗; 6. 染 PTAH 液 12～24 小时,室温;PTAH 液 56℃染几个小时,结果更确切完全可以代替室温下染色; 7. 蒸馏水洗; 8. 迅速脱水,透明,封固; PTAH 液自然氧化方法 油红 O 脂质和脂肪染色 用途：显示脂质和脂肪; 固定：10%幅尔马林; 冰冻切片：4～8 微米; 染色液配制 1．%油红 O 溶液 油红 O 100%异丙醇 100ml 加入少量的异丙醇溶解油红 O 并搅拌,逐渐加入剩余的异丙醇,加热溶液到 95℃左右,不超过 100℃,冷却到室温用滤纸过滤;或室温过夜,用特殊玻璃装置真空抽吸,配制的溶液在室温中可保存数年;如果液体表面有膜形成可以用一张薄纸片除去; 2．85%异丙醇溶液 异丙醇 100% 85ml 蒸馏水 15ml 3．Gill’s 苏木精 染色步骤 1． 空气中干燥切片 30min,用 10%福尔马林固定 5min; 2． 蒸馏水洗 3 次; 3． 100%异丙醇 5min,防止切片上的水带入油红 O 染液中 4． 油红 O 液 60℃染色 8 分钟; 5． 85%异丙醇溶液洗 5 分钟; 6． 蒸馏水洗 3min; 7． Gill’s 苏木精染色 30 秒; 8． 流水冲洗 3min; 9． 蒸馏水洗 2 次; 10． 甘油明胶封片; 结果：脂肪红色,细胞核淡蓝色; 改良油红 O-糊精染脂肪色法 Churukian 2000 固定：新鲜冰冻组织中性缓冲福尔马林; 切片：冰冻切片 5 微米,SuperFrost 载玻片贴片,空气中晾干切片; 试剂配制： 油红 O 液 油红 O 0.5g 纯异丙醇 100ml 混合后过夜 糊精水溶液 糊精 1g 蒸馏水 100ml 工作液 储备液油红 O 液 60ml 糊精水溶液 40ml 或油红 O 液 油红 O 0.9g 纯异丙醇 180ml 搅拌过夜 糊精水溶液 糊精 1.2g  蒸馏水 120ml 工作液 油红 O 液 180ml 糊精水溶液 120ml 放置 1 天或更长时间,液体可稳定数月;使用前过滤; 染色步骤 1. 切片直接放入过滤的油红 O-糊精液中染色 20 分钟; 2. 流水稍冲洗; 3. 对比染色用 Gill Ⅱ苏木精染 20-30 分钟; 4. 流水冲洗返蓝; 5. 水溶性封固剂封固; 结果： 脂肪 灿烂红色 核 蓝色; Dextrin, bacteriological grade or Type Ⅲ Sigma, from com. Dextrin is hydrolyzed com starch. VWRVWR Scientific also has small quantities; must be most soluble form of dextrit 劳克监牢蓝法 劳克监牢蓝属于铜-钛菁染料 copper-phthalocyanine dye,在酒精溶液中具有与髓鞘磷脂结合的染色特性,再经过中性红或焦油紫复染还能染出神经元的胞核及尼氏小体,而且对髓鞘着色反应具有强化作用; 固定：10%福尔马林生理盐水或福尔马林-钙液; 切片：石蜡切片 15-20 微米,火棉胶或冰冻切片均可; 试剂配制： 1. 劳克监牢蓝液 劳克监牢蓝 MBS 0.1g 10%醋酸液 95%酒精 100ml 染液配制后过滤使用,可以长期保存; 2. %中性红水溶液 染色步骤 1． 切片脱蜡入无水酒精;冰冻切片直接入无水酒精; 2． 放入染液中染色 8～16 小时,60℃,染色缸需要密封; 3． 经 70%酒精,然后蒸馏水洗; 4． %碳酸锂水溶液分色,石蜡切片 10～30 秒,厚冰冻切片 10 分钟; 5． 再经 70%酒精继续分色两次,每次 30～60 秒;至灰、白质区分清晰;如果还不清晰可继续分色; 6． 蒸馏水洗; 7． %中性红水溶液加数滴冰醋酸复染 10min10～30min,视镜检、分色而定; 8． 70%酒精进行复染分色,至细胞核及尼氏小体呈红色; 9． 正丁醇脱水两次,3～5min/次,二甲苯透明,中性树胶封固; 结果：髓鞘蓝色,细胞核及尼氏小体红色; 注：复染还可应用①PAS,②Mallory 磷钨酸-苏木精法显示神经胶质,③Holmes 度银显示轴索,④油红 O 显示溃变退化的髓鞘; 改良 Glees 和 Marsland 染色法 试剂： 1． 20%硝酸银水溶液： 2． Glees 溶液：20%硝酸银 30ml,无水酒精 20ml,氨水;将酒精加入硝酸银液中,立即出现乳白色沉淀再逐滴加入氨水直到沉淀溶解为止;最后再滴加 4 滴氨水,过滤后使用; 3． 5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠 5g,加蒸馏水至 100ml; 染色步骤 1． 石蜡切片脱蜡至蒸馏水; 2． 预热 37℃20%硝酸银水溶液浸染 30mins 切片为淡黄色; 3． 不洗,直接入 10%福尔马林液直到液体变清为止; 4． 快速过 Glees 溶液后,再放入 Glees 溶液 30 秒～1 min; 5． 取出切片,用滤纸吸干组织周围多余 Glees 溶液; 6． 不洗,直接放入 10%福尔马林液还原 2～3mins,更换 2～3 次 10%福尔马林液; 7． 自来水洗,然后换蒸馏水洗; 8． 5%硫代硫酸钠水溶液固定切片 5mins; 9． 充分自来水洗; 10． 95%酒精,无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固; 结果：神经元轴突及神经纤维-黑色,背景-黄色; ※ ①第5步应镜下控制,如浸度不够深可再重复第4步一次;②所用玻璃器皿,玻片应化学纯净,这样可减少非特异性着色及氨银夜污染;  碱性磷酸酶染色法 Gomori 钙法 Gomori 1951,改良 固定：福尔马林钙 4℃; 切片：冰冻切片,后固定; 试剂配制： 孵育媒介液配制 2%β甘油磷酸钠 2%巴比妥钠 2%硝酸钙 5ml 1%氯化镁 蒸馏水 孵育媒染液的最终 pH ～;巴比妥钠起着媒介缓冲作用而镁离子作为酶的激活剂; 染色步骤 1. 适当固定后切片至水;切片放入孵育媒介液 37℃孵育 25 分钟到 6 小时; 2. 充分蒸馏水洗; 3. 重复洗; 4. 切片用 2%硝酸钴处理 3 分钟; 5. 充分蒸馏水洗; 6. 重复洗; 7. 切片浸入 1%硫化铵 2 分钟; 8. 充分蒸馏水洗; 9. 甲基绿氯仿提取对比染色; 10. 充分自来水洗; 11. 甘油-明胶封固; 结果： 活跃的碱性磷酸酶 棕黑色 核 绿色 说明： a. 为了方便保存贮存液 按 20ml 批次配制; b. 孵育时间各异根据制备的类型,冰冻切片需要的时间最短; 琥珀酸脱氢酶 succinate dehydrogenase,SDH 染色 1. 在下面液体内 37℃孵化 30min; 1L 琥珀酸钠 15ml 2L 磷酸盐缓冲液 15ml NBT 30mg 2. 调整 pH 至依次入 30%→60%→90%→60→30%丙酮时间延长会褪色,操作要迅速;30%可省略 3. 水洗 4. 甘油明胶封片 作为氧化酶的 SDH 与 NADH-TR 同样存在着局限性;NBT 被还原后产生甲腊 formazan颗粒沉淀;染色结果也接近于 NADH-TR,但颜色较淡,肌纤维类型也较难分别;但与NADH-TR 相比,线粒体特异性较强,对线粒体脑肌病的诊断很有帮助; 乳酸脱氢酶 lactate dehydrogenase,LDH 染色 1. 下面液体内 37℃孵化 30min; 乳酸钠 NBT 30mg NAD 12mg mol/LTris 盐酸缓冲液 30ml 调整 pH 至 2. 依次入 30%→60%→90%→60→30%丙酮,时间要短; 3. 水洗 4. 甘油明胶封片 与 NADH-TR 和 SDH 相比,LDH 染色性最差,肌纤维类型的区分也很困难;除特殊情况外,观察氧化酶反应 NADH-TR 以很充分,不影响疾病的诊断; ATP 酶染色方法一 试剂使用如下： 1. 甘氨酸缓冲液 甘氨酸 氯化钠 蒸馏水 1000ml 2. 氯化钙缓冲液 甘氨酸缓冲液 500ml 1 M 氯化钙 100ml M NaOH 350ml 大约 用 1 M NaOH 调普 pH 3. 醋酸缓冲液 pH M 醋酸 M 醋酸钠 蒸馏水 100ml 4. ATP Disodium salt,Sigma chemicals Ltd 用于工作液 ATP 5mg 蒸馏水 数滴 用数滴蒸馏水溶解 ATP 5. 二硫苏糖醇 1 mM 每月更换新液 6. 2% 氯化钴液 7. 1% 硫化铵液 新鲜配制 8. 1% 氯化钙液 9. 反应混合液 1 滴二硫苏糖醇 DTT 1 mM 和 ATP 工作液加到 10ml 氯化钙缓冲液中 常规 ATP 酶法 pH 按下列步骤执行 1. 冰冻切片 8 微米贴到盖玻片上 2. 反应混合液 1 滴二硫苏糖醇 DTT 1 mM 和 ATP 工作液加到 10ml 氯化钙缓冲液中立式染色缸中 37℃ 30 分钟 3. 1% 氯化钙液充分洗 2～3 分钟 4. 2% 氯化钴液 2 次 每次 1 分钟 5. 蒸馏水彻底冲洗 4 次 6. 1% 硫化铵液 新鲜配制 30 秒 此步骤在通风橱内进行 7. 颜色显影后用蒸馏水冲洗,甘油明胶封固 ATP 转换酶染色法如下 1. 切片放入 pH 或 pH 醋酸缓冲液 37℃ 10 分钟 2. 迅速用 1:4V/V 稀释氯化钙缓冲液洗 3. 常规 ATP 酶反应液处理,但用 1:4V/V 蒸馏水稀释氯化钙缓冲液洗之前另外加 ATP 和二硫苏糖醇 DTT 1 mM 我们发现新鲜冰冻切片染色结果好,冷冻后放置几天的冰冻切片也能成功的染出结果; ATPase 染色方法二 本方法是区别肌纤维类型最好的染色方法,要稳定染色方法需要下一番功夫;区别Ⅰ和Ⅱ型肌肉纤维比较难的原因在于前处理液的 pH 值准确性问题;技术书明确给的前处理液的pH 值,但肌病下的 pH 值. 虽然能够区别肌纤维类型,但有时候颜色较淡,或者有斑点,原因多半是硫化氨质量问题造成的结果;注意选用高质量的化学试剂,开封后按说明妥善保存; 染好的切片放一段时间发现切片组织上的染色褪色,放置几个月后染色甚至会消失,这种现象多半是组织脱水不净或水溶性封片剂质量不好造成的原因;对于 ATPase 染色的保存传统的封片剂加拿大树胶最好;  Results PRE-INC pH TYPE 1 TYPE 2A TYPE 2B TYPE 2C light 0 +1 dark +3 dark +3 dark +3 dark +3 light 0 intermediate +1 +2 intermediate +1 +2 dark +3 light 0 light 0 intermediate +1 +2 酸性磷酸酶 Acid phosphatase 染色 1. 在冷却到 4℃的下述液体中固定 10min; 巴比妥醋酸盐缓冲液 12ml 丙酮 18ml 2. 水洗 3. 下述液体中 37℃孵育 60min; 4%亚硫酸钠 副品红液 将两种液体混合,室温放置一段时间加入蒸馏水; Naphtol AS-B 1 phosphate 15mg N,N-dimethyl formamide 每次分别配制这两种液体,然后混合,临用时加入巴比妥醋酸盐缓冲液最后 pH 值调整为～用 2N NaOH 调 Ph 4. 水洗 5. %甲基绿 30 秒对核对比染色 6. 水洗 7. 甘油明胶封片 副品红液 2N-HCl 50ml,加入盐酸副品红 2g,轻微加热溶解,室温冷却,过滤保存; 巴比妥醋酸盐缓冲液 醋酸盐 巴比妥钠 蒸馏水 140ml HCl 90ml 大约 酸性磷酸酯酶染色在巨噬细胞溶酶体内大量存在和包体内有自噬反应时呈阳性; 乙酰胆碱酯酶 acetylcholinesterase,AChE 染色 1. 下述液体中 37℃孵育 15～30min Acethyl thiocholine iodide 蒸馏水 % 醋酸钠 % 醋酸 % 柠檬酸钠 % 硫酸铜 % 铁氰化钾 2. 水洗 3. Harris 苏木精 1min 4. 水洗 5. 脱水,二甲苯透明 6. 中性树胶封片 乙酰胆碱酯酶存在于神经肌肉接头处,所以比较容易辨认;孵化时间过长时,反应部位膨胀变形; 非特异性酯酶 nonspecific esterase 染色 1. 下述液体中 37℃孵育 30min 4%亚硝酸钠 副品红液 与酸性磷酸酶染色相同 mol/L 磷酸缓冲液 30ml 1% α-醋酸萘酚/丙酮 调整 pH 至 2. 水洗 10min 以上 3. 脱水,二甲苯 4. 中性树胶封片 L 磷酸缓冲液 Na2HPO4 蒸馏水 500ml 1% α-醋酸萘酚/丙酮 α-醋酸萘酚 1g 丙酮 100ml 孵育过程中容易出现沉淀,所以应该彻底用水冲洗; 常用试剂 序号 中文名称 英文名称 缩写 货号 1 还原型辅酶Ⅰ Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced NADH Sigma N8129 2 还原型辅酶Ⅰ Nicotinamide adenine ANDH Sigma N8129 3 硝基四唑氮蓝 Nitro blue tetrazolium NBT Sigma N6876 4 硝基四唑氮蓝 Nitrotetra Zolium Blue Sigma N6876 5 二甲亚砜 DMSO GOMORI 三色法染色 序号 中文名称 英明名称 缩写 货号 1 冰醋酸 Glacial Acetic Acid Fisher A507-500 2 铬变素 2R Chromotrope 2R Sigma C3143 3 固绿 FCF Fast Green FCF Sigma F7258 4 磷钨酸 phosphotungstic acid; PTA Sigma P4006 三磷酸腺苷酶 ATP 染色 序号 中文名称 英文名称 缩写 货号 1 三磷酸腺苷,二钠 Adenosine triphosphate, disodium salt Sigma A5394 2 硫化铵 Ammonium sulfide Fisher A705-250 3 无水氯化钙 Calcium Chloride, anhydrous Sigma C4901 4 氯化钻 Cobalt chloride hexahydrate ACS Sigma C3169 5 盐酸 Hydrochloric acid Fisher A144-500 6 醋酸钠 Sodium acetate, trihydrate Sigma S9513 7 巴比妥钠 Sodium barbital5,5' dietyl barbituric acid Sigma B0500 8 氢氧化钠 Sodium Hydroxide Fisher S318 序号 中文名称 英文名称 缩写 货号 1 TRIS-base 6791 2 TRIS-HCI 3253 3 天青石蓝 B 206342 4 红色氧化汞 213357 5 封片剂 Permount-Fisher SP15-100 Fisher SP15-100 。