【最新word论文】五灵胶囊药效作用的有效成分【医学专业论文】.doc

1五灵胶囊药效作用的有效成分作者：王胜春，胡咏武，王俊琴，李晓玮，贺雪梅 【关键词】 肝损伤 【Abstract】 AIM: To investigate the active components producing the pharmacodynamic effects in WuLing Capsules. METHODS: Liver cells were separated and the model of liver cell injuries was established. The pharmacodynamic role of WuLing capsules was demonstrated by pharmacodynamic test. The chemical components of WuLing capsules were analyzed by HPLC chromatograms and UV spectrum, and the pharmacodynamic effects of four kinds of control substance were observed by the test of cell pharmacodynamics. RESULTS: The DGlaN group active enzyme of ALT, AST, MAO and MDA rose respectively to (881.8±231.7) nkat/L, (1256.9±265.1) nkat/L, (32.3±2.3) nkat/L and (1.0±0.6) μmol/L, which were more marked than those in normal group (P<0.05). The drug serum in WuLing capsules antagonized the injuries of liver cell induced by DGlaN and the enzyme activeness of ALT, AST, MAO and MDA decreased respectively to (421.8±288.4) nkat/L, (980.2±113.4) nkat/L, (21.7±5.5) nkat/L and (1.5±1.0) μmol/L, notably lower than those in model group (P<0.05). Four kinds of control substance markedly decreased the level of high enzyme activity that was induced by DGlaN and there were obvious action of restoration and protection on the injuries of liver cells induced by DGlaN. CONCLUSION: Schizandrol A, Schisandrin B, Crytanshinone and Tanshinone ⅡA are effective components of WuLing capsules in retarding the injuries of liver cells. 【Keywords】 WuLing capsule； liver injury； active component 【摘要】 目的： 探讨五灵胶囊产生药效作用的活性成分. 方法： 分离肝细胞并建立肝细胞损伤模型，血清药效学试验证实五灵胶囊药效作用，HPLC 色谱和紫外光谱分析含药血清中五灵胶囊化学成分，同时采用细胞药效学试验观察4种对照品的药效作用. 结果： 模型组培养上清 ALT，AST，MAO，MDA 酶活性分别升高至(881.8±231.7) nkat/L， (1256.9±265.1) nkat/L， (32.3±2.3) nkat/L，(1.0±0.6) μmol/L，与正常组比较（P<0.05） ；五灵胶囊含药血清能有效地拮抗 DGlaN对肝细胞损伤，细胞上清液中 ALT，AST，MAO，MDA 酶活性分别降低至(421.8±288.4) nkat/L，(980.2±113.4) nkat/L，(21.7±5.5) nkat/L，(1.5±1.0) μmol/L，显著低于模型组（P<0.05） ；4 种对照品能明显降低由 DGlaN诱导肝细胞损伤时所致升高的酶谱活性水平，对 DGlaN损伤的肝细胞有显著的修复和保护作用. 结论： 醇甲、乙素、隐丹参酮和丹参酮ⅡA 是五灵胶囊阻滞肝细胞损伤的有效活性成分. 【关键词】 五灵胶囊；肝损伤；活性成分 0引言 2五灵胶囊是治疗慢性肝炎的有效中药复方制剂［1］ ，其成分复杂产生药效作用的化学成分难以确定，这对该药质量标准制定的合理性和如何有效地控制产品质量带来了困难，因此探讨该药活性成分成为必要，本实验我们采用含药血清与对照品的细胞药效试验，并结合分析含药血清中化学成分，同时与对照品进行对照试验，来探寻五灵胶囊产生药效作用的化学成分. 1材料和方法 1．1 材料 ① 动物：SD 大鼠，质量（200±20）g，♂（由第四军医大学实验动物中心提供） ，动物合格证号：医动证字 SC×K（军）200205； ② 试剂与试药： D氨基半乳糖（DGLaN）：（重庆医科大学提供） ；无酚红 DMEM培养基：（USA.Gibco 公司产品） ；新生小牛血清（NBS） （杭州四季青提供，用前 56℃ 30 min灭活） ；二甲基亚砜（DMSO）：（AR，华美物制品公司提供） ；甲醇，异丙醇：（色谱醇，TEDIA 公司产品） ；五味子醇甲（醇甲）纯度：99 %、五味子乙素（乙素）纯度：98%、丹参酮 IIA对照品纯度：99%（中国药品生物鉴定所提供） ；隐丹参酮对照品由本室分离纯化制备并经氢谱（HNMR）确证，纯度：99%；五灵胶囊：（由西京医院药剂科生产，批号：020207） ；③ 仪器：（BB16/贺利气体培养箱，德国 HERAES公司） ；美国 Waters公司 600型 HPLC系统；2996 紫外检测器；2996 型二极管阵列检测器；Millenium 32数据处理系统；日本岛津 UV 2501型分光光度计；美国 MD100生化分析仪. 1.2色谱条件 Hypersil C18柱（5.0 mm×150 mm，5 μm） ；柱温：室温；流动相：甲醇水（80∶20） ；流速：0.8 mL/min；检测波长：270 nm，在此条件下能检出隐丹参酮、乙素、丹参酮 IIA并达到基线分离，各成分保留时间隐丹参酮 11.3 min、乙素 12.9 min、丹参酮 IIA 17.6 min.醇甲 HPLC分析，流动相：甲醇水（13∶7） ；色谱柱、流速、检测波长同上. 1.3含药血清的制备及含量测定取 20 wk龄大鼠 21只，♂，随机分成空白血清组、含药血清Ⅰ组和Ⅱ组. 空白血清组灌胃蒸溜水 10 mL/kg，含药血清Ⅰ组和Ⅱ组分别灌胃五灵胶囊药粉 10.0 g/kg和 6.25 g/kg，每日 1次，连续 3 d，第 4日给药 2 h后，乌拉坦麻醉(ip, 250 mL/L)，无菌操作腹主动脉取血，放置 30 min，3000 r/min，离心 20 min，分离血清. 含药血清Ⅰ组和Ⅱ组待测化学成分分析：取血清 0.7 mL,加硫酸铵 0.25 g，再加乙腈甲醇（4∶1） 4 mL，振荡抽提 1 min，3500 r/min，离心 10 min，取上清液置 40℃水浴上氮气吹干，沉淀加甲醇溶解至 1 mL，混匀，置 EP管中-20℃过夜，次日按色谱条件（HPLC 法）分析 4种化学成分及含量.另取混合空白血清 0.7 mL，共 5份，依次加入 312.5，62.5，12.5，2.5 和 0.5 mg/L的对照品溶液，同上法测定各对照品吸收度值并绘制对照品标准曲线.外标法分析含药血清Ⅰ组和Ⅱ组血清中 4种化学成分及含量. 余下各组血清按剂量组合并混匀，置 56℃水浴灭活 30 min，分装于 EP管内置-20℃冻存，为体外含药血清药效试验的供试品. 1.4供试品液的制备完全 DMEM培养液： 取小牛血清 10 mL加 DMEM培养液90 mL，备用；0.5 mmol/L DGlaN供试液：精密称取 DGlaN 5.38 mg，加完全DMEM培养液溶解至 10 mL，微孔滤膜除菌，-4℃冷藏，用时加完全 DMEM培养液稀释至 50 mL；空白血清供试液：取空白血清与完全 DMEM培养液以 2∶8 混合，即得；含药血清Ⅰ组和Ⅱ组供试液：分取 2组含药血清与完全 DMEM培养液分别以 2∶8 混合，即得；4 对照品供试液：取用二甲基亚砜溶解至 1 g/L各对照品液，加完全 DMEM使终浓度 100, 50, 25 μg/L 3 剂量，用前配制. 31.5血清药效学试验取 12 wk龄大鼠 2只，♂，腹腔注射 250 mL/L乌拉坦麻醉，按程涛等［2］介绍方法操作制备原代肝细胞，肝细胞重悬于 200 mL/L小牛血清 DMEM培养液中，调整细胞密度为 2×106/mL，接种于 24孔培养板内，置37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养 48 h，换液继续培养 12 h，吸弃上清液，分成 6组，每组 6孔.正常组、 DGlaN组、 空白血清组、模型组、含药血清Ⅰ组和Ⅱ组.正常组、空白血清组加完全 DMEM培养液 1 mL，其余各组每孔均加 0.5 mmol/L DGlaN供试液 1 mL，培养 24 h，吸弃上清液；正常组、 DGlaN 组加完全DMEM培养液， 空白血清组及模型组加 200 mL/L空白血清供试液，含药血清Ⅰ组和Ⅱ组分别加含药血清供试液培养 20 h，收集取尽培养上清测定ALT，AST，MAO 和 MDA；各组肝细胞再加完全 DMEM培养液继续培养 20 h，收集培养上清测定 ALT，AST，MAO 和 MDA，检测含药血清的延迟效应. 1.6对照品对肝细胞修复作用试验细胞制备方法同 1.5，分组；正常组、DGlaN组、醇甲+乙素组、隐丹参酮组、丹参酮 IIA组；正常组加完全 DMEM培养液 1 mL，其余各组每孔肝细胞均加含 0.5 mmol/L DGlaN供试液 1 mL，培养 24 h，吸弃上清液.正常组、DGlaN 组加完全 DMEM培养液 1 mL，对照品组每组为 3剂量（100，50，25 mg/L） ，分别加入相应剂量的对照品供试液 1 mL，每剂量重复 8孔，置 37℃ 50 mL/L CO2孵箱内继续培养 24 h，收集各组细胞培养上清，测定细胞酶谱活性.1.7 对照品对肝细胞的保护作用试验细胞制备方法同 1.5，分组同 1.6，正常组、DGlaN 组加完全 DMEM培养液，对照品组每组为 3剂量（100，50，25 mg/L） ，分别加入相应剂量的对照品供试液 1 mL，每剂量重复 8孔，置 37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养 24 h，吸弃上清液，正常组加完全 DMEM培养液 1 mL，其余各组均加 0.5 mmol/L DGlaN供试液 1 mL，继续培养 20 h，收集各组培养上清测定细胞酶谱活性. 统计学处理： 数据用 x±s表示，采用 SPSS 10.0软件统计.对 Tab 1~4数据进行 Kruskalwallis秩和检验，对 Tab 5数据行 Wilcoxon秩和检验. 2结果 2.1含药血清对 DGlaN所致肝细胞损伤的影响在体外培养条件下，原代肝细胞经台盼蓝染色活性为 97%，与 0.05 mmol/L DGlaN供试液作用 24 h，培养上清ALT，AST, MAO和 MDA酶活性值均显著高于正常肝细胞组（P<0.01） ，肝细胞产生损伤.模型。