嗅成鞘细胞移植对AD大鼠脑内COX活性和线粒体超微结构的影响临床医学论文.doc

嗅成鞘细胞移植对AD大鼠脑内COX活性和线粒体超微结构的影响_临床医学论文 作者：姚柏春 孙天敏 王金勇 李勇 王配军 李文春【摘要】 目的 探讨嗅成鞘细胞(OECs)移植对阿尔茨海默病(AD)大鼠脑内COX活性和线粒体超微结构的影响方法 SD大鼠双侧海马注射Aβ1～40，建立AD大鼠模型实验动物分为四组：正常对照组、AD模型组、OECs移植组、人工脑脊液(MCSF)注射组，每组12只体外原代培养OECs并将其移植至AD大鼠双侧海马运用行为学测试、组织化学、原位杂交结合图像分析以及电镜等技术和工具，观察、比较各组大鼠学习记忆能力、海马CA1区线粒体细胞色素氧化酶（COX）活性、细胞色素氧化酶Ⅱ型亚基(COⅡ)mRNA表达，以及CA1区神经元线粒体超微结构等指标的变化结果 与正常对照组比较，AD模型组大鼠空间学习记忆能力、海马CA1区线粒体COX活性及COⅡmRNA表达明显降低(P<0.05)，线粒体数量减少，结构不清、肿胀、空泡样变、嵴断裂；OECs移植明显上调上述指标(P<0.05)，并对线粒体超微结构有明显的保护作用结论 OECs移植通过改善AD大鼠学习记忆能力、提高海马COX活性和COⅡmRNA表达以及保护线粒体等作用，对大鼠AD具有明显的 治疗 效果。

【关键词】 阿尔茨海默病；细胞色素氧化酶；线粒体；嗅成鞘细胞；移植【Abstract】Objective To observe the effect of olfactory ensheathing cells (OECs) transplantation on cytochrome oxidase (COX) and the ultrastructure of hippocampal neurons mitochondrion in A1zheimer′s disease (AD) rats. Methods AD model was established by Aβ1～40 injected into hippocampus CA1. The rats were randomly divided into normal control, model, OECs transplantation and the manpower cerebral spinal fluid (MCSF) injected groups. There were 12 rats each group. OECs were cultured in vitro and injected into AD rat′s hippocampus. The ability of learning and memory was verified by the performance of Morris water maze task. The activity of COX in rat′s hippocampus CA1 was detected with the method of enzyme histochemical staining coupled with computer image analysis system. The expression of COⅡmRNA was observed by in situ hybridizajtion. Ultrastructural changes of neuron mitochondrion in rat′s hippocampus CA1 were viewed under transmisson electron microscope. Results Compared with the normal control group, the learning and memory ability of Aβinjected rats were lower, the number and ultrastructure of hippocampus neuron mitochrondrion had distinct change, the activity of COX and the expression of COⅡmRNA in hippocampus CA1 of the animals model of AD had been markly declined. OECs transplantation could improve above indexes. Conclusions The efficacy of OECs on AD maybe partly result from improving the abilities of spatial 1earning memory, the activities of COX, the expression of COⅡ mRNA and protecting hippocampus neuron mitochrondrion.【Key words】Alzheimer′s disease; Cytochrome oxidase; Mitochondrion; Olfactory ensheathing cells; Transplantation　　阿尔茨海默病(AD)的发病机制与神经元中的线粒体能量代谢障碍关系密切〔1〕；而细胞色素氧化酶(COX)又是线粒体呼吸链的关键酶，其活性下降可直接干扰呼吸链的 电子 传递，进而影响神经细胞的能量代谢〔2〕。

目前临床对AD治疗的药物虽能够减轻AD的症状，但对海马神经元线粒体超微结构与COX活性改善不够理想〔1，2〕嗅成鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)是具有增殖分化能力并在中枢神经系统和周围神经系统均能促进轴突再生、激活内源性干细胞的胶质细胞；主要应用于脊髓损伤、脑损伤等神经离断损伤中神经轴突的修复新近有学者研究发现OECs移植对AD等神经退行性病变有一定的效果，因而OECs移植被视为可解决这一矛盾的治疗策略之一〔3，4〕为此，本实验观察OECs移植对AD大鼠脑内COX活性和线粒体超微结构的影响，探讨OECs移植对大鼠AD的治疗效果　　 1 材料与方法 　　1.1 实验动物与主要试剂　　健康雄性SprageDawley(SD)大鼠48只，SPF级，3～4月龄，体重210～260 g，由本院实验动物中心〔许可证号：SCXK(鄂)20050008〕提供人工脑脊液（manpower cerebral spinal fluid，MCSF）(mmol/L)组成：NaCl 124.0(7.254 g)，KCl 3.0(0.223 5 g)，MgSO4·7H2O 1.0(0.246 g)，KH2PO4 1.2(0.163 2 g)，葡萄糖10.0(1.8 g)，NaHCO3 25.0(2.1 g)，CaCl2 1.0(0.111 g)，pH 7.2～7.4。

通过Morris水迷宫筛选实验动物，去除先天痴呆（潜伏期平均值>50 s）和游泳姿势不良者；将合格大鼠48只随机分为四组：正常对照组、AD模型组、OECs移植组、MCSF注射组，每组12只　　1.2 建立大鼠AD模型　　将大鼠β淀粉样蛋白1～40(Aβ1～40)溶于无菌生理盐水(5 μg/ml)，放入37℃温箱孵育2 w，使其变成丝状聚集状态用35 g/L的戊巴比妥钠（35 g/kg）将大鼠麻醉后，按包新民等〔4〕编著大鼠脑立体定位图谱、用江湾I型C通用立体定向器定位：（AP3.5 mm，ML±2.0 mm，DV2.7 mm）即为海马注射点双侧海马注射2 μl（10 μg）Aβ1～40，10 min内注完，并留针10 min单笼饲养至大鼠完全清醒，肌肉注射青霉素Aβ1～40海马注射后第7周用Morris水迷宫检测，若大鼠学习记忆能力明显减退，随机从其中抽取10％经Nissl染色、6E10免疫组织化学、刚果红组织学染色，出现神经细胞减少、Aβ斑和老年斑（SP），则该批大鼠确定为AD模型成功鼠(本实验室既往工作)〔3～8〕随机抽取AD模型成功鼠36只分为AD模型组、OECs移植组、MCSF注射组，每组12只。

　　1.3 OECs培养　　OECs的分离培养参照 文献 〔9〕，从成年SD大鼠嗅球取材，进行OECs原代培养选用2.5个月龄SD大鼠(由郧阳医学院实验动物中心提供)，取嗅球，去除其表面毛细血管，顺嗅球长轴方向夹碎嗅球，保留富含OECs的嗅神经层及嗅球颗粒层胰蛋白酶消化后，用体积分数为20%的胎牛血清的DF12培养基，将其制成1×106/ml单细胞悬液，接种于未涂胶的底面积为25 cm2的斜口塑料培养瓶中，利用差异贴壁法进行纯化培养，低亲和力神经生长因子受体蛋白免疫组化染色鉴定OECs用质量浓度为10 μg/ml的Hoechst33342标记OECs，制成单细胞悬液，细胞浓度为50 000个/μl　　1.4 OECs海马内移植　　将AD模型成功鼠在实验动物中心继续普食喂养3 w，即Aβ1～40海马注射4 w后，用于下一步实验用35 g/L的戊巴比妥钠（35 g/kg）将大鼠麻醉后，按包新民等〔5〕编著大鼠脑立体定位图谱、用江湾I型C通用立体定向器定位：（AP3.5 mm，ML±2.0 mm，DV2.7 mm）即为大鼠海马移植点OECs移植组双侧海马内各注射20 μl OECs，速度为1 μl/min，20 min内注完，并留针10 min。

MCSF注射组双侧海马内各注射20 μl MCSF，骨蜡封闭颅骨，缝合头皮单笼饲养至大鼠完全清醒，肌肉注射青霉素，密切观察实验动物4 w　　1.5 Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力　　①定位航行实验：历时5 d，从第1天起，每天分上、下午各训练1次训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，让大鼠寻找、游向并爬上平台，记录其潜伏期、运行时间；每次训练时间为120 s如果大鼠在120 s内未找到平台，须将其引至平台；这时潜伏期记为120 s，并记录其错误次数1次；每次训练后让其在平台上停留15 s②空间搜索实验：在第6天撤除水下平台，随机选取一入水点，在同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录其在120 s内跨过原平台相应位置的次数和第一次通过平台的时间　　1.6 标本制作　　于OECs海马内移植后第28天　　1.6.1 COX组织化学染色　　参照Crockett法，将大鼠麻醉后打开胸腔，经左心室、升主动脉快速灌注200 ml生理盐水（右心耳切开）洗净血液，然后灌注0.1 mol/L PB配制的10 g／L多聚甲醛·25 g／L戊二醛400 ml进行固定1 h后取脑，后固定2 h，放入150，200，300 g／L蔗糖磷酸盐缓冲液，梯度脱水，隔夜沉底。

OCT包埋后入-70℃冷丙酮速冻，移至-28℃恒冷箱切片机平衡温度后连续冠状切片，片厚6 μm切片在37℃下湿盒中孵育，孵育液组成为DAB 40 mg、细胞色素C 20 mg、蔗糖1.4 g、过氧化氢酶2 mg、PB 20 ml1 h后用PBS冲洗终止反应常规酒精脱水、透明、封片　　1.6.2 原位杂交法检测COⅡmRNA表达　　经大鼠左心室灌注固定(4%多聚甲醛，0.1 mol/L磷酸缓冲液，pH 7.2)剥取大脑，按常规固定、脱水，冰冻切片，切片厚30 μm以地高辛标记寡核苷酸5′GCTCTTCTATAATAGGGGATGTGGCGTCTT3′作探针，按照博士德试剂盒说明书操作，DAB显色并进行图像分析， 计算 阳性细胞数和平均吸光度　　1.6.3 电镜观察　　将大鼠麻醉、灌注、固定后取脑并进行后固定1 h分离海马CA1区，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋，。