小球藻固定CO2能力与油脂积累条件研究.docx

    小球藻固定CO2能力与油脂积累条件研究    梁梁 杜风光 陈嘉山 刘秀花 梁峰摘 要：小球藻生长速率快、易于培养且能进行光合作用，可作为生物法固碳的优良材料而CO2作为全球变暖的元凶，如何减少大气中CO2含量已是当今热门话题但目前对小球藻去除CO2的研究中，大规模培养的较少因此，本实验以120L玻璃封闭的自制大容器为培养器，以HSM1添加植物激素6-BA 0.5mg/L为培养基，培养时持续通入CO2和空气，通气量为1L/min，CO2的浓度为6.56%，并进行光照、水循环等，对小球藻进行大规模培养结果表明：小球藻对CO2的去除率最高达24.09%，鲜重为3.624g/L，产油能力为0.14g/LKey：小球藻;大规模培养;生物固碳;生物燃料：Q945 ：A ：1003-5168（2019）17-0131-05Abstract： Chlorella has a high growth rate， is easy to cultivate and can perform photosynthesis， and can be used as an excellent material for biological carbon fixation. CO2， as a greenhouse gas， is the main culprit of global warming. How to reduce CO2 content in the atmosphere is a hot topic today. In the current study of CO2 removal by Chlorella， large-scale cultures are less common. Therefore， in this experiment， a large-scale culture of Chlorella vulgaris was carried out in a 120L glass-enclosed self-made container with HSM1 and phytohormone 6-BA 0.5mg/L as the medium. During the culture， CO2 and air were continuously injected with a ventilation rate of 1L/min and a concentration of CO2 of 6.56%. Light and water circulation were also carried out to culture Chlorella vulgaris on a large scale. The results showed that the highest CO2 removal rate of Chlorella was 24.09%， fresh weight was 3.624g/L， and oil production capacity was 0.14g/L.Keywords： Chlorella;large-scale culture;biological carbon fixation;biofuel小球藻（Chlorella）為绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，直径3～8μm，内有一个周生、杯状或片状的色素体，是一种高效的光合植物。

微藻固碳已经成为消减温室气体排放的新的研究热点[1]自养型藻类主要依靠CO2和光能生长，在光合作用过程中，藻类吸收CO2，并将其转化为糖、蛋白质、油脂等生物质能藻类对光量子（太阳能）的吸收转化率可达8%～10%，而一般农作物的光能转化率只有1%～3%[2]每生产100t微藻，约可吸收利用470t碳元素，可转化掉185t CO2因此，藻类养殖是控制和减少大气中CO2的一种有效途径[3]在300mL的小培养容器中，对CO2的去除率为27.69%，固碳量达到256.86mg/（L·h）[4]，而小球藻去除CO2的研究必将迈向大容器、大规模培养小容器培养与大容器培养中存在许多微小且令人意想不到的问题，这些问题也是在实验的深入研究中所必须要面临的对于以消减大气中CO2为目的大规模微藻培养，其主要利用微藻生长速度快、易于培养且能达到较高密度培养的特性来进行本次实验本实验选用实验室分离纯化的一株小球藻，生长迅速，抗逆性强，且能在杂藻及杂菌中优势生长，可作为CO2减排藻株以HSM1添加6-BA为其培养基，并在培养过程中，对光照强度、通气量、容器内水循环等进行控制本文主要分析大容器培养中，每个时期的CO2去除率，并观察其变化，分析变化的内外原因。

同时，观察并测量每个时期的生物量，最后将其回收并测量藻内含油量，以为后续生物精炼方向的研究提供参考1 材料与方法1.1 试验材料试验菌株为小球藻，来自于生物精炼河南省工程实验室本实验的基本培养基为HSM1培养基，其成分为：NH4Cl 0.500g/L，K2HPO4 1.440g/L，KH2PO4 0.720g/L，MgSO4·7H2O 0.020g/L，CH3COONa 2.000g/L，CaCl2·2H2O 0.010g/L，Trace 1mL其他涉及培养基有以下三种BBM培养基：NaNO3 0.250g/L，KH2PO4 0.175g/L，K2HPO4 0.075g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.025g/L，NaCl 0.025g/L，Trace 1mLDS培养基：NaNO3 0.300g/L，CO（NH2）2 0.150g/L，K2HPO4·3H2O 0.050g/L，FeC6H5O7 0.006g/L，CaCl2·2H2O 0.025g/L，Trace 1mLSE培养基：NaNO3 0.250g/L，K2HPO4·3H2O 0.075g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.025g/L，KH2PO4 0.180g/L，NaCl 0.025g/L，FeCl3·6H2O 0.010g/L，Fe-EDTA 1mL。

1.2 试验方法1.2.1 CO2发生器的制作取两个2L的雪碧空瓶，并贴上A、B标签A瓶装200g柠檬酸加600mL水，B瓶装200g小苏打加300mL水，摇匀待用然后取双出口瓶盖两个，并贴上A、B标签A盖顶部一个口接压力表，另一个口连接B盖，下部接有通到瓶底的管子;B盖一个口连接A盖，其接口下部接有连接斜三角的管子（使其内液体单向流动，即A瓶液体能进入B瓶，B瓶液体不能进入A瓶，且B瓶的气体能进入A瓶），另一个口为出气口，其上接有调节出气量的阀门接着盖上瓶盖，挤压A瓶，使其内柠檬酸进入B瓶与小苏打反应;松开A瓶，B瓶气体进入A瓶，所以两瓶气压相等重复挤压几次后，随着小苏打与柠檬酸反应，内部气压升高，以致挤压不动时，打开出气口5s左右，使B瓶气压降低，A瓶的柠檬酸就会再次进入B瓶，关紧出气口摇晃B瓶，使其产生更多CO2，待压力表上压力为1.5左右时，出气口接上通往培养器内的管子即可为了保证安全，在压力表处接上自动泄压阀，也可手动泄压，防止瓶内压力过高1.2.2 培养装置的制作光照：用8条LDE长条灯带环绕在玻璃培养器周围，顶部装上吸顶灯环形替换光源测得内部光照强度大约为3 000lx循环：玻璃培养器内部装上两个多功能潜水泵，提供内部的水循环，且保证一定的搅拌效果，防止过多的小球藻沉淀。

通气：外部装上超静音增氧泵和CO2发生器，通过橡胶管接入培养器内;每根橡胶管装上止逆阀，防止内部水倒流;培养器内的橡胶管末端接上空气细化器，使气体均匀进入培养器电源的接通：以上仪器均接于智能控制插座上，可自动控制以上仪器开启和关闭的时间气密性检查：开启增氧泵，同时集气口接上集气袋，观察集气袋是否有气体进入，正常进入即制作完成1.2.3 培养基的选择及改良用250mL的三角瓶对本实验室小球藻进行培养基的选择及改良实验本实验用BBM、DS、SE、HSM1四种培养基培养小球藻，对其生长情况及油脂积累情况进行比较，选出最优同时，用最优培养基添加不同的植物激素2，4-D、6-BA 0.5mg/L，对其生长情况及油脂积累情况进行比较，选出最优作为大容器培养的培养基1.2.4 菌种的活化配制HSM1固体培养基20mL，然后和事先包扎好的10个平板一起放入灭菌锅灭菌灭过菌之后，在超净工作台中开始倒完平板，待平板凝固后拿出斜面保存着的菌种，进行四区划线最后，将划好线的平板放入培养箱内培养4～5d1.2.5 种子液的配制配制好HSM1培养基后，对其进行灭菌灭完菌，待冷却后，拿出之前活化好的平板，在超净工作台中，挑取单菌落接入锥形瓶里的培养基中。

将接好的种子液进行光照培养4～5d1.2.6 计数接种对培养了5d的种子液进行计数，并通过计算得出大约接种子液100mL，使得玻璃培养器中的含藻量为105个/mL1.2.7 气体的测量用气体收集袋收集培养器内1min所排出的气体，再利用排水法得出气体的体积CO2浓度的测量：用收集袋收集培养器内的气体，再用便携红外气体分析仪测量收集袋中气体的CO2浓度根据气体流量和通入气体与流出气体中CO2的浓度变化算出小球藻对CO2的去除量和去除率[5]1.2.8 生物量的测定浊度法：从玻璃培养器中取小球藻培养液，合理稀释后在680nm下测定其光密度值，以OD680来衡量小球藻的相对生长量鲜重法：在玻璃培养器充分搅拌后，取100mL培养液，8 000r/min离心后将上清液倒掉，并将离心管倒置于报纸上，使其水分充分流失，称重1.2.9 回收及含油量的测定将衰亡期的培养液进行沉淀、离心回收，并取10g的鲜菌于离心管中，加入6mol/L盐酸6～8mL，用玻璃棒搅拌均匀，超声波30min后放入沸水浴中水浴1d，取出放到冰中冷却后，加入95%乙醇10mL，用力摇匀，置于冰浴中10min向离心管中加入5mL石油醚（30～60），5mL乙醚摇匀，4 800r/min，离心4min，小心用吸管吸取醚层液，放入已知重量的试管中（重量记为[m1]）。

再加入3ml石油醚（30～60），3mL乙醚摇匀，4 800r/min，离心4min，小心用吸管吸取醚层液，放入同个试管中在烘箱中由低到高逐渐升温（不要暴沸），至85℃烘箱中干燥1h，取出冷却称重，直到达到恒重，重量记为[m2]，既得小球藻油脂重（g）为[m=m2-m1]，则可算得鲜菌的含油量2 結果分析2.1 不同培养基对小球藻生长和油脂积累的影响在培养小球藻的过程中，培养基是否合适至关重要因此，在大规模培养之前，要对培养小球藻的培养基进行选择优化，选出最优培养基，并将其改良成为适合本实验的培养基，然后再开始进行实验小球藻L4在4种培养基BBM、DS、SE、HSM1中培养，培养10d后小球藻的生长情况如图1所示图1中OD680为原液稀释10倍的数值从图1可以看出，以HSM1为培养基能使小球藻迅速生长，且具有较大的生物量这可能与HSM1含有较大量的NH4Cl和CH3COONa有关，NH4Cl为小球藻提供充足的氮源，而CH3COONa具有缓冲作用，防止培养基过酸而导致藻细胞大量死亡小球藻L4在4种培养基BBM、DS、SE、HSM1中培养，培养10d后小球藻的油脂积累情况如图2所示从图2可以看出，以HSM1为培养基收获的总油脂最多，这与其生物量大有关。

因此，本实验室保藏的小球藻适合生长于HSM1培养基中该培养基能使小球藻在短时间内快速生长，符合培养小球藻去除CO2的实验要求，并能在后期提供生物精炼方向的研究在以下所有实验中均以HS。