大豆子叶节再生体系的建立.pdf

2013．6 作物杂志Crops 大豆子叶节再生体系的建立 刘思言 高玮 夏海丰 姚丹 关淑艳 金慧卿 曲静 王丕武 ( 吉林农业大学生命科学学院，130118，吉林长春； 通化市农业科学研究院，135007，吉林梅河口3吉林农业大学农学院，130118，吉林长春) 摘 要 以吉农28、吉农27、吉农17三个基 因型大豆子叶节作为外植体，采用正交实验设计 方法，对大豆的基因型和子叶节再生中植物生长 调节剂浓度进行了研究结果表明：适合大豆子 叶节不定芽诱导的基因型是吉农27，最佳诱导培 养基是MS+6-BA 3．0mg／L-I-IBA 0mg／L+2，4．D OmdE适合大豆子叶节不定芽继代的基因型是 吉农17，最佳继代培养基是MS+6．BA 1．0mg／L+ IBA 0．1 mg／L适合大豆子叶节不定芽增殖的最 佳基因型是吉农27，最佳增殖培养基是MS+6一BA 1．0mg／L+NAA 0．1mg／L+GA 1．0mg／L 关键词 大豆；子叶节；再生体系 大豆是世界最主要的油料作物以及高蛋白粮 饲兼用作物，发展大豆生产对改善人民的食物结 构、满足植物蛋白、油脂需求、发展畜牧业和食品 工业都有重要的意义 ，20世纪80年代末， Hinehee等 和McCabe等 第一次获得了转基因 大豆植株，从此以后有越来越多的科研人员和越 来越多的实验室开始从事大豆的转基因技术研 究，2012年全球转基因大豆的种植面积达到1．09 亿hm ，发展转基因大豆产业具有良好前景。

目前，大豆的遗传转化中亟待解决的首要问 题是要建立一个高效的转化再生体系常见的再 生体系包括愈伤组织再生体系、原生质体再生体 系、子叶节再生体系和胚尖再生体系等 近 年来，研究和应用比较多的是子叶节再生体系和 胚尖再生体系 卜 子叶节再生体系具有取材 作者简介：刘思言，副教授，主要从事作物生物技术研究 王丕武为通信作者，教授，主要从事作物生物技术及作 物遗传育种研究 基金项目：吉林农业大学科研启动基金(201242)；吉林省科技厅科 技发展计划项目(201101111)；吉林省教育厅科学技术 研究资助项目(2011—41)；吉林省科技厅项目 (20120215)；吉林省科技厅成果转化补助项目 (20095044) 收稿日期：2013—08—09；修回日期：2013—10—08 42 方便、不受季节限制、诱导率高、生长快、不易发生 变异、再生植株健壮易成活等优点，尽管以子叶节 再生体系也存在诸如丛生芽的相互抑制、不易伸 长、再生困难、转化时会出现嵌合体，但目前仍被 认为是用于大豆遗传转化的比较理想的外植体 本试验以大豆子叶节为外植体，研究不同的植物 生长调节剂和大豆的不同基因型对大豆子叶节不 定芽的诱导、继代、增殖的影响，找出不同阶段的 最适基因型和植物生长调节剂浓度，旨在建立稳 定、高效的大豆遗传转化受体系统，为大豆的转基 因研究奠定基础。

1材料与方法 1．1 供试材料 本实验所用的3个大豆品种分别为吉农28、 吉农27、吉农17，均由吉林农业大学生物技术中 心提供 1．2实验方法 1．2．1 无菌实生苗的获得 挑选色泽鲜亮、粒 大、饱满、种皮无破损、无霉病斑的大豆种子，用 75％酒精消毒30s，用0．1％HgC12溶液中浸泡 10min，再用无菌水冲洗4～5次，然后将3种种子 接种于MS培养基上，按以下条件培养：温度27± 1℃；光照12h，黑暗12h5d后取鲜绿的子叶节处 膨大的大豆无菌苗，在子叶节下3～4mm处切去下 胚轴，纵向切开子叶，横向切去1／3，切除顶芽和腋 芽，每粒种子获得两个子叶节外植体 1．2．2不定芽的诱导将子叶节接种于激素浓 度不同的不定芽诱导培养基上，以MS培养基为基 本培养基，每个处理3瓶，每瓶3个外植体13d 后统计每个外植体诱导形成的芽数，找出大豆子 叶节的最佳诱导培养基本实验采用四因素三水 平的L9(3 )正交设计，共9组处理，如表1 1．2．3 不定芽的继代培养接种14d后，将三个 基因型大豆子叶节不定芽从外植体上切下，接种 作物杂志Crops 2013．6 表1 大豆子叶节不定芽诱导实验因素水平表 于激素浓度不同的继代培养基中进行培养。

本实 验采用三因素三水平正交设计，共9组处理，如 表2 表2大豆子叶节不定芽继代培养实验因素水平表 1．2．4不定芽的增殖培养继代27d后，将不定 芽转入激素浓度不同的增殖培养基中培养，找出 最佳增殖培养基本实验采用四因素三水平正交 设计，共9组处理，如表3 表3 大豆子叶节不定芽增殖实验因素水平表 2结果与分析 2．1不定芽的诱导 取培养5d后的无菌实生苗的子叶节为外植 体，以MS为基本培养基，分别接种到激素浓度不 同的培养基上，13d后进行记录，结果见表4，彩插 3图版I由K值综合分析可以确定，最优组合是 A2B3c1D1，即吉农27，3．0mg／L的6-BA，0mg／L的 IBA，0mg／L的2，4-D组合在一起根据极差R值 的大小确定4个因素对大豆子叶节不定芽诱导影 响的主次顺序依次为D>B>C>A，即2，4．D的影 响最大，其次是6-BA、IBA，基因型的影响最小 表4不同条件下大豆子叶节不定芽 诱导正交试验方案及结果分析 2．2不定芽的继代培养 将诱导产生的不定芽转入到激素浓度不同的 继代培养基中，13d后统计，结果见表5、彩插3图 版Ⅱ由K值综合分析可以确定，最优组合是 A3B1c1即基因型为吉农17，6-BA为1．0mg／L，IBA 为0．1mg／L。

根据极差R值的大小确定三个因素 对大豆子叶节不定芽继代培养的影响的主次顺序 依次为A>B>C即基因型的影响最大，其次是 6-BA，IBA的影响最小 2．3 子叶节的增殖培养 将丛生芽转入激素浓度不同的增值培养基 中，49d后记录，结果见表6，彩插3图版Ⅲ由K 值综合分析可以确定，最优组合是A：B cD，即吉 农27，1．0mg／L的6-BA，0．1mg／L的NAA，1．0mg／ L的GA 组合在一起最差组合是A，B c，D ，即 吉农17，0．5mg／L的6-BA，0．3mg／L的NAA， 0．5mg／L的GA，组合在一起根据极差R值的大 43 2013．6 作物杂志Crops 表5 不同条件下大豆子叶节不定芽继代 培养正交试验方案及结果分析 小确定4种因素对大豆子叶节不定芽增殖培养的 影响的主次顺序依次为A>D>C>B即基因型 的影响最大，其次是GANAA、6一BA的影响最小 表6不同条件下大豆子叶节不定芽增殖 培养的正交试验方案及结果分析 项目 基因型 m．~-／ L me,／ L m e／ ( J ( ) f 1．1 (％J 3 讨论 孙听 认为从激素调节来看，子叶节培养中 44 不同浓度的6-BA影响不定芽的诱导率、不定芽数 量和芽的伸长。

低浓度的6．BA有利于芽的伸长， 但芽的数量少，不定芽诱导率低；高浓度的6．BA 可提高不定芽诱导率，但诱导的芽数量过多、生长 慢、易黄化脱落 本研究在诱导培养基中添加适当的6-BA、IBA 和2，4．D实验表明2，4一D对大豆子叶节不定芽 的诱导没有促进作用反而抑制不定芽的诱导，6． BA与生长激素IBA配合使用对不定芽的形成和 伸长有促进作用细胞分裂素6一BA可刺激子叶 节不定芽的产生大豆基因型的不同，与IBA配 比不同，最适的6-BA浓度也不同 6一BA的作用是促进子叶节分化不定芽，GA 的作用是促进再生苗伸长，6-BA与GA 比值高 时，易于不定芽发生；比值低时易于芽的伸长，因 此，两者浓度的适宜配比直接关系到大豆子叶节 不定芽的伸长本实验在增殖培养基中6．BA、 GA 的基础上添加了适当的NAA，NAA是植物生 长调节剂，能促进细胞分裂与扩大6一BA和GA 的比值相同时随着基因型和NAA的浓度不同伸长 情况也不同 4 结论 运用正交实验方法，研究了不同基因型和不 同浓度的植物生长调节剂对大豆子叶节不定芽的 诱导、继代、增殖的影响，得出以下结论：(1)适合 大豆子叶节不定芽诱导的基因型是吉农27，最佳 诱导培养基是MS+6-BA 3．0mg／L+IBA 0mg／L+ 2，4一D 0mg／L。

2)适合大豆子叶节不定芽继代的 基因型是吉农17，最佳继代培养基是MS+6一BA 1．0mg／L+IBA 0．1mg／L3)适合大豆子叶节不 定芽增殖的最佳基因型是吉农27，最佳增殖培养 基是MS+6-BA 1．0mg／L+NAA 0．1mg／L+CA 1．0mg／L 不定芽的诱导、伸长往往是多种激素相互平 衡及协同作用的结果，激素的比例尤为重要，运用 正交设计的方法，极好地优化了实验设计，在探求 最佳激素配比方面大大增强了试验的可操作性 参考文献 [1]李茂福，李睿，傅永福，等．农杆菌介导大豆遗传转化的影响因 素．山地农、 生物学报，2006，25(4)：283—286． 作物杂志Crops 2013．6 [2]HincheeM A W，ConnorWard D V，New ell C A，et．a1．Product ion of transgenic soybean plants using Agrobacterium—mediated DNA transfer．Nature Biotechnology，1988，6：915—922． [3]McCabe D E，Swain W F，Martinell B J，et．a1．Stable transformation of soybean(Glycine max)by particle acceleration．Nature Biotech- nology，1988，6：923—926． [4]James C．Globa 1 Status of Commercialized Biotech／GM Crops： 2009．ISAAA Brief No．39．ISAAA：Ithaca，NY，USA，2009． [5]张艳，南相日，满为群，等．大豆离体培养及高频再生基因型的 筛选．植物生理学通讯，2010，46(11)：1135—1139． [6]徐鹏飞，张淑珍，李文滨，等．大豆组织培养再生体系的研究进 展．中国农学通报，2005，21(9)：47—49． [7]Christianson M L，Wamick D A，Carlson P S．A morpho—geneti- cally competent soybean suspension culture．Science，1 983，222： 632—634． [8]周思君，尹光出，雷勃钧，等．从大豆幼胚诱导胚胎发生再生体 系．大豆科学，1989，8(1)：39—44． [9]周思君，尹光出，雷勃钧，等．从大豆幼胚诱导器官发生再生植 株．大豆科学，1990，9(4)：285—290． [1O]Cheng T Y，Saka H，Voqui—Dinh T H．Plant regeneration from soybean cotyledonary node segments in culture．Plant Science Let． ter，1980，19：91—99． [11]刘金华，王丕武，武丽敏，等．大豆子叶节丛生芽的诱导．吉林 农业大学学报，2001，23(4)：15—17． [12]王萍，王军军，商德虎，等．影响大豆子叶节丛生芽形成的诱导 因子研究．吉林农业科学，2001，26(6)：20—23． [13]崔欣．大豆子叶节受体系统的建立及农杆菌转化的研究．东北 农业大学，2002． [14]龚学臣，季静，王萍，等．苗龄与6-BA浓度对大豆子叶节丛生 芽诱导的影响．吉林农业大学学报，2005，27(2)：128—130． [15]孙昕．吉育47大豆子叶节遗传转化体系的建立与优化．长春： 吉林大学，2013． [16]胡润芳，张玉梅，张广庆，等．菜用大豆胚尖转化再生体。