蛋白质工程原理及其在食品工业中的应用.ppt

第六章蛋白质工程原理及其在食品加工中的应用第一节第一节 蛋白质工程的原理和方法蛋白质工程的原理和方法 ￿￿￿￿￿￿￿￿以蛋白以蛋白质结质结构和功能的研究构和功能的研究为为基基础础，运用，运用遗传遗传工程的工程的方法，借助方法，借助计计算机信息算机信息处处理技理技术术的支持，从改的支持，从改变变或合成基或合成基因入手，定向地改造天然蛋白因入手，定向地改造天然蛋白质质或或设计设计全新的人工蛋白全新的人工蛋白质质分子，使之具有特定的分子，使之具有特定的结结构、性构、性质质和功能，能更好地和功能，能更好地为为人人类类服服务务的一种生物技的一种生物技术术 一、蛋白一、蛋白一、蛋白一、蛋白质质工程的概念工程的概念工程的概念工程的概念￿￿￿￿￿￿￿￿天然的正常构象是蛋白天然的正常构象是蛋白质质的最佳状的最佳状态态，它既能高效地，它既能高效地发挥发挥功能，又便于机体的正常功能，又便于机体的正常调调控，因而极易失活而中止控，因而极易失活而中止作用但在生物体外，特作用但在生物体外，特别别是工是工业业化的粗放生化的粗放生产产条件下，条件下，这这种可被灵敏种可被灵敏调节调节的特性就表的特性就表现为酶现为酶分子性分子性质质的极不的极不稳稳定定性，性，导导致致难难以持以持续发挥应续发挥应有的功能，成有的功能，成为为限制其推广限制其推广应应用用的主要原因。

如温度、的主要原因如温度、压压力、机械力、重金属、有机溶力、机械力、重金属、有机溶剂剂、、氧化氧化剂剂以及极端以及极端pHpH值值等都会影响它的作用等都会影响它的作用￿￿￿￿￿￿￿￿蛋白蛋白质质工程技工程技术针对这术针对这一一现现状，状，对对天然蛋白天然蛋白质进质进行改行改造改良或全新造改良或全新设计设计模模拟拟，使目的蛋白，使目的蛋白质质具有特殊的具有特殊的结结构和构和性性质质，能，能够够抵御外界的不良抵御外界的不良环环境，即使在极端境，即使在极端恶恶劣条件下劣条件下也能也能继续发挥继续发挥作用，因而蛋白作用，因而蛋白质质工程具有广工程具有广阔阔的的应应用前景 ￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿主要包括：主要包括：分子分子分子分子遗传遗传学学学学、、蛋白蛋白蛋白蛋白质结质结构功能构功能构功能构功能相关的理相关的理论论与技与技术术￿￿￿￿￿￿￿￿分子分子分子分子遗传遗传学学学学：完整：完整cDNAcDNA的克隆技的克隆技术术、、DNADNA序列的快速序列的快速测测定技定技术术、、DNADNA序列推序列推测测蛋白蛋白质质序列的多序列的多维维程序系程序系统统、原、原核生物及真核生物基因表达核生物及真核生物基因表达过过程的程的调调控、基因的定位控、基因的定位诱变诱变及随机及随机诱变诱变理理论论与技与技术术等。

等￿￿￿￿￿￿￿￿蛋白蛋白蛋白蛋白质结质结构功能分析构功能分析构功能分析构功能分析：蛋白：蛋白质质一一级结级结构－氨基酸序列构－氨基酸序列的分析；的分析；X X光光单单晶衍射晶衍射结结构分析技构分析技术术；两；两维维和三和三维维核磁共核磁共振振结结构分析技构分析技术术；蛋白；蛋白质结质结构数据构数据库库的建立；蛋白的建立；蛋白质质功能功能的的酶酶学和免疫研究技学和免疫研究技术术；蛋白；蛋白质质分子力分子力场场、能、能态态、自由能、自由能等生物物理学研究技等生物物理学研究技术术；；计计算机模算机模拟处拟处理理结结构分析系构分析系统统等  两大两大类类理理论论与技与技术术相互关相互关联联、相互促、相互促进进，借助其他，借助其他多多类类学科的支持，完成学科的支持，完成对对蛋白蛋白质质分子分子结结构与功能分析、构与功能分析、归类归类，，进进一步展开突一步展开突变变蛋白蛋白质质的分子模的分子模拟拟与与预测预测，，实现实现蛋白蛋白质质的改造，以及全新蛋白的改造，以及全新蛋白质质的分子的分子结结构与功能的构与功能的设设计计，在，在计计算机模算机模拟拟的基的基础础上，上，进进行蛋白行蛋白质质分子的化学修分子的化学修饰饰、合成的、合成的实际实际操作，操作，验证验证分子分子设计设计的的结结果，果，获获得具有得具有特定特定结结构、性构、性质质和功能的目的蛋白和功能的目的蛋白质质。

二、蛋白二、蛋白二、蛋白二、蛋白质质工程的原理工程的原理工程的原理工程的原理 （一）蛋白（一）蛋白（一）蛋白（一）蛋白质质工程的工程的工程的工程的目的目的目的目的 对对目的蛋白目的蛋白质进质进行行结结构和功能上的构和功能上的设计设计与改造，以与改造，以满满足人足人们们特定条件下的需要以蛋白特定条件下的需要以蛋白质结质结构与功能的研究构与功能的研究为为基基础础，掌握蛋白，掌握蛋白质质活性中心的活性中心的结结构，包括催化中心和构，包括催化中心和调节调节中心的空中心的空间间构象，了解构成中心的各氨基酸残基及其构象，了解构成中心的各氨基酸残基及其侧链侧链基基团团的位置，再借助的位置，再借助计计算机算机图图像与像与处处理系理系统统的模的模拟进拟进行分行分子子辅辅助助设计设计，提出，提出对对目的蛋白目的蛋白质质的改建或构建方案，确定的改建或构建方案，确定活性中心的氨基酸残基活性中心的氨基酸残基组组成，并成，并辅辅助助设计设计和和预测预测其其结结构功构功能的能的变变化 （二）蛋白（二）蛋白（二）蛋白（二）蛋白质质工程的工程的工程的工程的组组成部分成部分成部分成部分￿￿￿￿1.￿￿￿￿1.蛋白蛋白质质放大放大扩扩增系增系统统￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿由由组组织织提提取取的的少少量量纯纯化化的的蛋蛋白白质质，，通通常常只只有有mgmg。

作作为为出出发发蛋蛋白白质质分分子子，，先先解解析析部部分分肽肽段段的的一一级级结结构构，，根根据据遗遗传传密密码码设设计计并并合合成成相相应应的的同同位位素素标标记记寡寡聚聚核核苷苷酸酸片片段段，，再再由由此此从从基基因因文文库库中中调调出出该该蛋蛋白白质质的的克克隆隆化化基基因因，，转转入入DNADNA序序列列分分析析系系统统测测定定DNADNA序序列列并并克克隆隆化化，，最最后后通通过过表表达达载载体体系系统统扩扩增增蛋蛋白白质质的的量量，，达达到到能能够够分分析析出出发发蛋蛋白白质质的的结结构构功功能能的水平，通常需要蛋白的水平，通常需要蛋白质质量量为为g g ￿￿￿￿2.￿￿￿￿2.蛋白蛋白质结质结构功能分析及分子构功能分析及分子设计设计系系统统￿￿￿￿￿￿￿￿由上一系由上一系统获统获得足量的出得足量的出发发蛋白蛋白质质后，通后，通过过目前已目前已经经具具备备的蛋白的蛋白质结质结构分析方法，分析蛋白构分析方法，分析蛋白质质的一的一级结级结构和空构和空间结间结构X X X X光衍射分析晶体蛋白光衍射分析晶体蛋白光衍射分析晶体蛋白光衍射分析晶体蛋白质质的的的的结结构构构构，而，而三三三三维维核磁共振核磁共振核磁共振核磁共振法研究溶液中的蛋白法研究溶液中的蛋白法研究溶液中的蛋白法研究溶液中的蛋白质结质结构构构构，同，同时时研究研究该该蛋白蛋白质结质结构与功构与功能的关系，并将能的关系，并将结结果果输输入入计计算机算机图图像像处处理系理系统统和和结结构构处处理理系系统统，根据生物物理学原理以及已知蛋白，根据生物物理学原理以及已知蛋白质结质结构功能数据构功能数据库库的基本的基本规规律，从律，从结结构与功能研究出构与功能研究出发发，，进进行分子行分子结结构分构分析与模析与模拟拟，，进进一步一步辅辅助助设计设计和功能和功能预测预测，提出分子的，提出分子的预预期期性性质质、改造或构建方案，完成突、改造或构建方案，完成突变变蛋白蛋白质质的分子的分子设计设计或构或构建建过过程。

程 ￿￿￿￿3.￿￿￿￿3.突突变变蛋白蛋白质质的合成表达系的合成表达系统统￿￿￿￿￿￿￿￿将突将突变变方案通方案通过过分子分子遗传遗传学方法学方法实实施即蛋白施即蛋白质质的定点的定点突突变变技技术术，改造或构建方案通，改造或构建方案通过过合成突合成突变变寡聚核苷酸，引寡聚核苷酸，引入定位突入定位突变变，或采用其他方法引入突，或采用其他方法引入突变变，并，并进进入克隆系入克隆系统统分离出突分离出突变变DNADNA，以此作，以此作为为模板，引入模板，引入载载体表达系体表达系统统，，扩扩增增表达表达获获得大量的突得大量的突变变蛋白蛋白质质对获对获得的突得的突变变蛋白蛋白质进质进行行结结构、性构、性质质和功能的分析、和功能的分析、测试测试与判定，如符合分子与判定，如符合分子设计设计的的要求，要求，则获则获得目的蛋白得目的蛋白质质；如不能；如不能满满足足实际实际要求，要求，则则再由再由分子分子设计设计系系统统重新指重新指导设计导设计，，进进入新一入新一轮轮循循环环，最，最终获终获得得满满足人足人们们要求的目的蛋白要求的目的蛋白质质￿ ￿（三）蛋白（三）蛋白（三）蛋白（三）蛋白质质工程操作中的工程操作中的工程操作中的工程操作中的问题问题￿ ￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿例如更有效的例如更有效的cDNAcDNA克隆技克隆技术术，精确高效的定位突，精确高效的定位突变变技技术术，高效目的基因表达系，高效目的基因表达系统统等。

等￿￿￿￿￿￿￿￿例如准确地由一例如准确地由一级结级结构推构推测测高高级结级结构，构，肽链肽链折叠的精折叠的精确控制，蛋白确控制，蛋白质质的翻的翻译译后修后修饰饰，蛋白，蛋白质结质结构可构可变变性，分子性，分子动动力学与蛋白力学与蛋白质质功能的关系，蛋白功能的关系，蛋白质质在晶体、溶液以及在晶体、溶液以及细细胞中的不同存在状胞中的不同存在状态态及其及其对对蛋白蛋白质质性性质质、功能的影响等功能的影响等￿￿￿￿￿￿￿￿例如微量蛋白例如微量蛋白质质的的纯纯化化鉴鉴定技定技术术、更有效的蛋白、更有效的蛋白质结质结晶方法、晶方法、计计算机算机辅辅助系助系统统的有效性等的有效性等三、蛋白三、蛋白三、蛋白三、蛋白质质工程的基本步工程的基本步工程的基本步工程的基本步骤骤 ￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿1.1.分分离离纯纯化化目目的的蛋蛋白白，，使使之之结结晶晶并并作作X X晶晶体体衍衍射射分分析析，，结结合合核核磁磁共共振振技技术术等等其其他他方方法法的的分分析析结结果果，，得得到到其其空空间间结结果尽可能多的信息果尽可能多的信息￿￿￿￿2.￿￿￿￿2.对对目的蛋白目的蛋白质质功能作功能作详细详细的研究，确定它的功能域。

的研究，确定它的功能域￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿3.3.通通过过对对蛋蛋白白质质的的一一级级结结构构、、空空间间结结构构和和功功能能之之间间相相互关系的分析，找出关互关系的分析，找出关键键的基的基团团和和结结构￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿4.4.围围绕绕这这些些关关键键的的基基团团和和结结构构提提出出对对蛋蛋白白质质进进行行改改造造的方案，并用基因工程的方法的方案，并用基因工程的方法实实施￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿5.5.对对经经过过改改造造的的蛋蛋白白质质进进行行功功能能测测定定，，看看看看改改造造的的效效果如何￿￿￿￿6.￿￿￿￿6.重复重复4 4和和5 5两个步两个步骤骤，直到，直到获获得理想的得理想的结结果四、蛋白四、蛋白四、蛋白四、蛋白质质工程的主要研究方法工程的主要研究方法工程的主要研究方法工程的主要研究方法 ￿￿￿￿1.￿￿￿￿1.蛋白蛋白质质的分离的分离纯纯化化鉴鉴定方法、定方法、结结构分析方法、功能构分析方法、功能研究方法和研究方法和进进行行结结构改造的分子生物学研究方法构改造的分子生物学研究方法￿￿￿￿￿￿￿￿在在这这四四类类根据蛋白根据蛋白质质工程的操作步工程的操作步骤骤而划分的主要研而划分的主要研究方法中，蛋白究方法中，蛋白质质分离分离纯纯化化鉴鉴定方法与生物化学中的常定方法与生物化学中的常规规方法没有本方法没有本质质的区的区别别，是，是对许对许多多结结构、性构、性质质相似的一系列相似的一系列突突变变蛋白蛋白质质的分离、的分离、纯纯化和化和鉴鉴定，但其定，但其难难度要大得多，通度要大得多，通常需要运用多种高精度的方法才能常需要运用多种高精度的方法才能实现实现，如，如亲亲和和层层析、等析、等电电聚焦、免疫沉淀等。

聚焦、免疫沉淀等 ￿￿￿￿2.￿￿￿￿2.蛋白蛋白质质功能研究方法必功能研究方法必须须根据不同种根据不同种类类的蛋白的蛋白质质所所具有的不同功能，相具有的不同功能，相应应地采用不同的研究方法地采用不同的研究方法￿￿￿￿￿￿￿￿如如对对具有催化活性的蛋白具有催化活性的蛋白质质－－酶酶，，则则用用酶酶学的学的稳态动稳态动力学方法；力学方法；对对抗体抗体则则用免疫学方法；其他蛋白用免疫学方法；其他蛋白质质如激素、如激素、生生长长因子、受体因子、受体类类以及核酸以及核酸结结合合类类蛋白蛋白质质都有相都有相应应的研究的研究方法所有方法所有这这些蛋白些蛋白质质功能的研究中，建立一套高效、功能的研究中，建立一套高效、简简便的蛋白便的蛋白质质功能功能测测定方法是成功的关定方法是成功的关键键对对特定的蛋白特定的蛋白质质，，如果能如果能够够找到特异找到特异专专一性的一性的检测检测方法，可以极大地提高研方法，可以极大地提高研究的效率在分子生物学和蛋白究的效率在分子生物学和蛋白质质工程研究中，工程研究中，对对不同功不同功能蛋白能蛋白质质特异性特异性检测检测方法的研究，也是重要的研究方向之方法的研究，也是重要的研究方向之一。

一 （一）蛋白（一）蛋白（一）蛋白（一）蛋白质结质结构分析方法构分析方法构分析方法构分析方法￿￿￿￿￿￿￿￿蛋白蛋白质结质结构分析方法主要是指与研究蛋白构分析方法主要是指与研究蛋白质质的空的空间结间结构有关的理构有关的理论论与技与技术术主要包括主要包括主要包括主要包括：：￿￿￿￿￿￿￿￿蛋白蛋白质质一一级结级结构（即氨基酸序列）的构（即氨基酸序列）的测测定方法、蛋白定方法、蛋白质质晶体学、核磁共振法、蛋白晶体学、核磁共振法、蛋白质质折叠折叠过过程研究、蛋白程研究、蛋白质质生生物物理研究法以及蛋白物物理研究法以及蛋白质质工程的工程的计计算机算机辅辅助助设计设计与模与模拟拟研研究等￿ ￿￿￿￿￿1.￿￿￿￿1.蛋白蛋白质质一一级结级结构分析方法构分析方法￿￿￿￿￿￿￿￿蛋白蛋白质质一一级结级结构研究，即氨基酸序列的构研究，即氨基酸序列的测测定，其原理定，其原理是片段重叠、逐是片段重叠、逐级级降解、降解、cDNAcDNA以及以及质谱质谱法等几种，其中片法等几种，其中片段重叠和逐段重叠和逐级级降解是最常用的方法降解是最常用的方法￿ ￿￿￿￿￿2.￿￿￿￿2.蛋白蛋白质质构象研究方法构象研究方法￿￿￿￿￿￿￿￿在蛋白在蛋白质质高高级结级结构研究方面，构研究方面，X X光衍射和三光衍射和三维维核磁共核磁共振是蛋白振是蛋白质质空空间间构象研究最主要的分析手段，分构象研究最主要的分析手段，分别别用于用于对对结结晶蛋白晶蛋白质质和溶液中蛋白和溶液中蛋白质质空空间间构象的研究。

构象的研究X X光衍射主光衍射主要要对结对结晶蛋白晶蛋白质质的各向基的各向基团团的空的空间间排布排布进进行分析，行分析，对对蛋白蛋白质质分子的整体空分子的整体空间间构架研究作用很大而三构架研究作用很大而三维维核磁共振可核磁共振可以直接以直接对对水溶液中的蛋白水溶液中的蛋白质结质结构构进进行分析，溶液中的空行分析，溶液中的空间间构象更接近于生物体中的自然状构象更接近于生物体中的自然状态态，更能反映蛋白，更能反映蛋白质质在在执执行功能行功能时时的的实际实际构象状构象状态态 ￿￿￿￿3.￿￿￿￿3.蛋白蛋白质质折叠折叠过过程研究方法程研究方法￿￿￿￿￿￿￿￿蛋白蛋白质质折叠折叠过过程研究方法，也就是蛋白程研究方法，也就是蛋白质质折叠机理研折叠机理研究，是蛋白究，是蛋白质质化学及分子生物学最前沿的化学及分子生物学最前沿的课题课题之一￿ ￿￿￿￿￿￿￿￿￿目前目前对对蛋白蛋白质质折叠研究主要通折叠研究主要通过对过对蛋白蛋白质变质变性、复性性、复性过过程的程的热热力学和力学和动动力学的研究，以及力学的研究，以及对对折叠中折叠中间间体的研究体的研究而而进进行￿￿￿￿￿￿￿￿变变性、复性性、复性过过程反映了蛋白程反映了蛋白质质中中肽链肽链的折叠、卷曲的折叠、卷曲过过程。

定量地程定量地观观察、描述和研究蛋白察、描述和研究蛋白质变质变性、复性性、复性过过程，可程，可以研究以研究肽链肽链的折叠的折叠过过程热热力学研究反映了力学研究反映了过过程中的能量程中的能量状状态态，，动动力学研究反映了折叠、卷曲力学研究反映了折叠、卷曲过过程与程与时间时间之之间间的关的关系通过过研究折叠中研究折叠中间间体来研究折叠途径也是一种常体来研究折叠途径也是一种常见见的的方法 ￿￿￿￿￿￿￿￿蛋白蛋白质质从天然状从天然状态态到到变变性状性状态态，或从伸展状，或从伸展状态态折叠到折叠到天然构象，是一个天然构象，是一个渐变过渐变过程，其程，其间间必然要必然要经过许经过许多中多中间过间过渡渡态态，那些，那些较为稳较为稳定的定的过过渡渡态态是折叠是折叠过过程的限速步程的限速步骤骤，，这这种种较为稳较为稳定的定的肽链肽链构象称构象称为为折叠中折叠中折叠中折叠中间间体体体体，它可以有效地反，它可以有效地反映蛋白映蛋白质质的折叠途径尽管的折叠途径尽管绝绝大多数折叠中大多数折叠中间间体很不体很不稳稳定，定，由于三由于三维维核磁共振技核磁共振技术术的的发发展，加上展，加上氢氢交交换换技技术术及快速混及快速混合技合技术术的成熟，已的成熟，已经经可以有效地研究可以有效地研究这这些中些中间间体。

体 ￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿4.4.蛋白蛋白质质生物物理研究方法及生物物理研究方法及计计算机算机结结构模构模拟拟研究研究￿￿￿￿￿￿￿￿蛋白蛋白质质的的结结构研究方法，除了以上的构研究方法，除了以上的实验实验方法以外，方法以外，理理论论分子生物物理学方法也是重要的途径之一随着生物分子生物物理学方法也是重要的途径之一随着生物物理、化学以及数学学科的物理、化学以及数学学科的发发展，特展，特别别是分子力学、分子是分子力学、分子动动力学的力学的发发展及其与展及其与计计算机信息算机信息处处理技理技术术的的结结合与合与发发展，展，利用蛋白利用蛋白质质分子内部及其周分子内部及其周围环围环境原子之境原子之间间的作用，以的作用，以计计算机信息算机信息处处理系理系统为统为工具，研究蛋白工具，研究蛋白质质的能量、的能量、结结构、构、热热力学、力学、动动力学性力学性质质，，进进行蛋白行蛋白质质空空间结间结构构规规律研究和律研究和预测预测，，取得了突破性的取得了突破性的进进展￿￿￿￿￿￿￿￿理理论论分子物理学方法的建立，使蛋白分子物理学方法的建立，使蛋白质结质结构的研究构的研究摆摆脱了必脱了必须须完全依完全依赖实验过赖实验过程的程的传统传统模式，开辟了利用模式，开辟了利用计计算算机模机模拟拟研究的新思路，推研究的新思路，推动动了蛋白了蛋白质结质结构研究的构研究的进进程。

程 （二）分子生物学研究方法（二）分子生物学研究方法（二）分子生物学研究方法（二）分子生物学研究方法￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿基因工程方法，也称分子基因工程方法，也称分子遗传遗传学方法，是一学方法，是一类类涉及涉及遗传遗传物物质质基因（基因（DNADNA）的生物学理）的生物学理论论与操作技与操作技术术，包括寡，包括寡聚核苷酸（又称聚核苷酸（又称为为寡核苷酸）片段及基因的人工合成、寡核苷酸）片段及基因的人工合成、目的基因的克隆与分析、目的基因的定位目的基因的克隆与分析、目的基因的定位诱变诱变或随机或随机诱诱变变、目的基因在、目的基因在载载体系体系统统中的高效表达等中的高效表达等 ￿￿￿￿1.￿￿￿￿1.寡聚核苷酸片段及基因的人工合成寡聚核苷酸片段及基因的人工合成￿￿￿￿￿￿￿￿由于由于DNADNA自自动动合成合成仪仪的广泛的广泛应应用，寡聚核苷酸片段及用，寡聚核苷酸片段及基因的合成，即基因的合成，即DNADNA的化学合成，的化学合成，现现已已经经成成为为分子生物学分子生物学及及遗传遗传工程、蛋白工程、蛋白质质工程研究中的常工程研究中的常规规技技术术手段之一手段之一无无论论从合成寡聚核苷酸片段的从合成寡聚核苷酸片段的长长度，度，还还是合成的是合成的总总量来量来说说，都已，都已经经达到相当的达到相当的规规模水平。

合成的模水平合成的产产物物DNADNA片段也片段也有着多方面的用途，除合成全基因或改造基因有着多方面的用途，除合成全基因或改造基因这这一基本一基本用途外，用途外，还还可用作探可用作探针筛选针筛选目目标标基因，作基因，作为为引物用于基引物用于基因的定位因的定位诱变诱变或聚合或聚合酶链酶链式反式反应应（（PCRPCR），也可合成），也可合成连连接接接接头头（（1inker1inker）用于基因末端改造等，）用于基因末端改造等，还还可以用于研究可以用于研究基因的基因的调调控及基因与其他生物大分子的相互作用控及基因与其他生物大分子的相互作用 ￿￿￿￿2.￿￿￿￿2.目的基因的克隆与分析目的基因的克隆与分析￿￿￿￿￿￿￿￿应应用于蛋白用于蛋白质质工程中目的基因的克隆与分析技工程中目的基因的克隆与分析技术术，，与常与常规规基因工程中的方法没有本基因工程中的方法没有本质质的差的差别别一般也包含一般也包含下面几个基本部分：源下面几个基本部分：源DNADNA的的获获得；得；DNADNA片段与克隆片段与克隆载载体体的体外的体外连连接；重接；重组组后后载载体引入宿主复制放大建立克隆基体引入宿主复制放大建立克隆基因因库库；；筛选筛选基因基因库库，，获获得目的基因克隆；目的基因的得目的基因克隆；目的基因的结结构分析。

构分析 ￿￿￿￿3.￿￿￿￿3.目的基因的定位目的基因的定位诱变诱变￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿定点突定点突定点突定点突变变（（site-directed￿￿mutagenesissite-directed￿￿mutagenesis）技）技术术是是对对已知已知DNADNA序列的基因或基因片段中任意指定位置序列的基因或基因片段中任意指定位置进进行突行突变变的的技技术术它可以按照人它可以按照人们们的意愿在指定的位置的意愿在指定的位置实现实现核苷酸的核苷酸的取代、插入或缺失取代、插入或缺失￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿优优点点点点：比使用化学因素、自然因素：比使用化学因素、自然因素导导致突致突变变的方法具的方法具有突有突变变率高、率高、简单简单易行、重复性好的易行、重复性好的优优点，在蛋白点，在蛋白质质工程工程中主要中主要应应用于需要改用于需要改变变的氨基酸残基位置可以的氨基酸残基位置可以预预先确定的先确定的情况下￿￿￿￿￿￿￿￿目前常用的定点突目前常用的定点突变变方法：方法：寡核苷酸引物介寡核苷酸引物介寡核苷酸引物介寡核苷酸引物介导导的定点的定点的定点的定点突突突突变变、、PCRPCRPCRPCR介介介介导导的定点突的定点突的定点突的定点突变变和和盒式突盒式突盒式突盒式突变变。

￿￿￿￿￿￿（（1 1）寡核苷酸引物介）寡核苷酸引物介导导的定点突的定点突变变￿ ￿￿￿￿￿￿￿￿￿原理原理原理原理：用含有突：用含有突变变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合合酶酶的作用下启的作用下启动动DNADNA分子分子进进行复制，将引物中的突行复制，将引物中的突变变引入引入到基因中（到基因中（图图）￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿步步步步骤骤：：①①将待突将待突变变基因克隆到突基因克隆到突变载变载体上②②制制备备含含突突变变基因的基因的单链单链模板③③引物与模板退火引物与模板退火5’5’端磷酸化的突端磷酸化的突变变寡核苷酸引物，与待突寡核苷酸引物，与待突变变的核苷酸形成一小段碱基的核苷酸形成一小段碱基错错配配的异源双的异源双链链的的DNADNA④④合成突合成突变链变链，在，在DNADNA聚合聚合酶酶的催化下，的催化下，引物以引物以单链单链DNADNA为为模板合成全民的互模板合成全民的互补链补链，而后由，而后由连连接接酶酶封封闭闭缺口，缺口，产产生生闭环闭环的异源双的异源双链链的的DNADNA分子⑤⑤转转化和初步化和初步筛筛选选异源双异源双链链DNADNA分子分子转转化大化大肠肠杆菌后，杆菌后，产产生野生型、突生野生型、突变变型型的同源双的同源双链链DNADNA分子。

可以用限制性分子可以用限制性酶酶切法、斑点切法、斑点杂杂交法和交法和生物学法来初步生物学法来初步筛选筛选突突变变的基因⑥⑥对对突突变变体基因体基因进进行序行序列分析 ￿￿￿￿￿￿￿￿缺点缺点缺点缺点：常常会：常常会产产生突生突变变效率效率较较低的低的现现象，主要原因是象，主要原因是大大肠肠杆菌中存在甲基介杆菌中存在甲基介导导的碱基的碱基错错配修复系配修复系统统所致￿￿￿￿￿￿￿￿进进展展展展：近年来：近年来这这一方法已有了一方法已有了许许多改多改进进，如尿，如尿嘧啶嘧啶取取代法、缺口双代法、缺口双链链DNADNA法、双引物法等均是利用法、双引物法等均是利用对对大大肠肠杆菌碱杆菌碱基基错错配修复系配修复系统统的抗性来提高突的抗性来提高突变变率的另外也有人采用率的另外也有人采用改改进进的的质质粒作粒作为载为载体，省去了体，省去了单链单链模板的制模板的制备备步步骤骤，，节节省省了了时间时间￿ ￿￿￿￿￿￿￿（（2 2））PCRPCR介介导导的定点突的定点突变变法及其改法及其改进进— —大引物突大引物突变变法法￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿见书见书 （（3 3）盒式突）盒式突变变￿ ￿￿￿￿￿￿￿￿￿原理原理原理原理：利用一段人工合成的含基因突：利用一段人工合成的含基因突变变序列的寡核苷序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相酸片段，取代野生型基因中的相应应序列。

序列这这种突种突变变的寡核的寡核苷酸是由两条寡核苷酸苷酸是由两条寡核苷酸组组成，当它成，当它们们退火退火时时，按，按设计设计要求要求产产生克隆需要的黏性末端，由于不存在异源双生克隆需要的黏性末端，由于不存在异源双链链的中的中间间体，体，因此重因此重组质组质粒全部是突粒全部是突变变体，突体，突变变效率很高效率很高￿￿￿￿￿￿￿￿优优点点点点：如果将：如果将简简并的突并的突变变寡核苷酸插入到寡核苷酸插入到质质粒粒载载体分体分子上，在一次的子上，在一次的实验实验中便可以中便可以获获得数量众多的突得数量众多的突变变体，大体，大大减少了突大减少了突变变需要的次数，需要的次数，这对这对于确定蛋白于确定蛋白质质分子中不同分子中不同位点氨基酸的作用是非常有用的方法特位点氨基酸的作用是非常有用的方法特别别是是对对蛋白蛋白质质中中的指定位置的氨基酸残基，的指定位置的氨基酸残基，进进行一系列不同氨基酸残基取行一系列不同氨基酸残基取代以考察取代效果代以考察取代效果时时，非常有效非常有效 ￿￿￿￿￿￿￿￿目的基因的定位目的基因的定位诱变诱变，与随机，与随机诱变诱变一起都是体外基因一起都是体外基因诱变诱变最常用的方法。

定位最常用的方法定位诱变诱变法法对结对结构比构比较较清楚的基因或清楚的基因或蛋白蛋白质较为质较为适合，随机适合，随机诱变诱变法法则对则对了解了解较较少的基因或蛋白少的基因或蛋白质质比比较较适用￿￿￿￿￿￿￿￿随机随机随机随机诱变诱变法法法法不但不但对对研究研究对对象的基本性象的基本性质质要求要求较较少，少，还还能反能反过过来帮助分析基因或蛋白来帮助分析基因或蛋白质质的的结结构，由此思路构，由此思路发发展成展成分子分子进进化工程技化工程技术术，大大加快了，大大加快了对对生物大分子人工改造的生物大分子人工改造的进进程 ￿￿￿￿4.￿￿￿￿4.目的基因的高效表达系目的基因的高效表达系统统￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿目目的的基基因因表表达达系系统统中中，，以以大大肠肠杆杆菌菌（（E.coliE.coli））系系统统最最为为常常用用，，许许多多原原核核和和真真核核生生物物的的基基因因均均能能在在这这一一系系统统中中实实现现高高效效表表达达酵酵母母表表达达系系统统是是真真核核生生物物常常见见的的表表达达系系统统，，除除此此之之外外，，还还有有枯枯草草杆杆菌菌系系统统以以及及高高等等真真核核细细胞胞外外源源基基因因表达系表达系统统等。

等￿￿￿￿￿￿￿￿在分子生物学方法中出在分子生物学方法中出现现了一种全新的引入突了一种全新的引入突变变的方的方法，称法，称为为tRNAtRNAtRNAtRNA介介介介导导蛋白蛋白蛋白蛋白质质工程工程工程工程，它是在目的基因表达，它是在目的基因表达过过程程中引入突中引入突变变的方法该该方法是借助校正方法是借助校正tRNAtRNA定点定点掺掺入非天入非天然氨基酸，以提供蛋白然氨基酸，以提供蛋白质结质结构信息，改构信息，改进进蛋白蛋白质检测质检测与分与分离方法，甚至离方法，甚至赋赋予蛋白予蛋白质质某些新的特性某些新的特性 五、蛋白五、蛋白五、蛋白五、蛋白质质工程的意工程的意工程的意工程的意义义与展望与展望与展望与展望 ￿￿￿￿￿￿￿￿作作为为第二代第二代遗传遗传工程，蛋白工程，蛋白质质工程研究工程研究为为当代生物技当代生物技术术的的产业产业化化发发展注入了新的生命力它已展注入了新的生命力它已经经在蛋白在蛋白质药质药物物改造、改造、酶酶工程、抗体工程、分子工程、抗体工程、分子电电子器件和新型医学生物子器件和新型医学生物材料研制中材料研制中获获得越来越广泛的得越来越广泛的应应用￿￿￿￿￿￿￿￿已成功地已成功地设计设计并合成了以并合成了以α-α-螺旋和螺旋和β-β-折叠折叠层为层为主体主体的的简单简单蛋白蛋白质质，跨出了人工构建蛋白，跨出了人工构建蛋白质质的第一步。

同的第一步同时时蛋蛋白白质质工程正在推工程正在推动动一个从一个从预预定生物功能到期望的蛋白定生物功能到期望的蛋白质结质结构，再到构，再到编码编码基因及其表达的反向生物学的基因及其表达的反向生物学的发发展 ￿￿￿￿21￿￿￿￿21世世纪纪初的初的2020年年间间蛋白蛋白质质工程将工程将处处于迅速于迅速发发展展时时期，期，一方面，研究方法和技一方面，研究方法和技术术将日臻成熟；另一方面，通将日臻成熟；另一方面，通过过与与基因工程的密切基因工程的密切结结合，可望合，可望获获得一些有得一些有应应用价用价值值的成果但作但作为为以改造通以改造通过长过长期自然期自然进进化化产产生的蛋白生的蛋白质为质为目目标标的高的高新技新技术术，蛋白，蛋白质质工程在工程在实实用上尚有一系列用上尚有一系列严严重困重困难难有待研有待研究解决，在究解决，在产业产业化的方向上将有化的方向上将有艰难艰难的的历历程蛋白质质工程工程是希望与挑是希望与挑战战并存、并存、艰艰辛与辛与硕硕果同在的果同在的崭崭新研究新研究领领域 第二节第二节 蛋白质工程与食品加工蛋白质工程与食品加工 ￿￿￿￿￿￿￿￿葡萄糖异构葡萄糖异构酶酶（（GIGI），又称），又称D-D-木糖异构木糖异构酶酶，属微生，属微生物物酶类酶类。

19571957年最早在嗜水假年最早在嗜水假单单胞菌中胞菌中发现发现其活性，后其活性，后来又来又发现发现近百种近百种细细菌和放菌和放线线菌能合成菌能合成该酶该酶，其中，其中绝绝大多大多数数为为胞内胞内酶酶，只有极少数菌株能分泌胞外，只有极少数菌株能分泌胞外酶酶葡萄糖异葡萄糖异构构酶酶能将能将D-D-葡萄糖、葡萄糖、D-D-木糖和木糖和D-D-核糖等催化核糖等催化为为相相应应的的酮酮糖在体外一定条件下，它也能催化糖在体外一定条件下，它也能催化D-D-葡萄糖葡萄糖转转化化为为果果糖，因而成糖，因而成为为工工业业上制上制备备高果糖高果糖浆浆（（HFCSHFCS）的关）的关键酶键酶；；它它还还可用于含木聚糖可用于含木聚糖类类物物质发质发酵生酵生产产乙醇，是一种具有乙醇，是一种具有重大重大经济经济价价值值的工的工业业用用酶酶 一、葡萄糖异构一、葡萄糖异构酶（EC5.3.1.5EC5.3.1.5））￿￿￿￿1967￿￿￿￿1967年美国成功地年美国成功地进进行了行了GIGI的工的工业业化化应应用，以后西方用，以后西方国家主要的淀粉加工国家主要的淀粉加工业业都都转转向向GIGI技技术术生生产产各国又竞竞相利相利用生物高技用生物高技术术改造改造GIGI的的结结构、性构、性质质和功能，以提高和功能，以提高该酶该酶的的适适应应性，性，扩扩大大应应用用领领域。

由于葡萄糖异构域由于葡萄糖异构酶酶有有较较好的耐好的耐热热性，性，结结构也构也较稳较稳定，使它成定，使它成为为目前国目前国际际上公上公认认的研究蛋白的研究蛋白质结质结构与功能关系，建立完整蛋白构与功能关系，建立完整蛋白质质工程技工程技术术的最好模型的最好模型之一 （一）葡萄糖异构（一）葡萄糖异构（一）葡萄糖异构（一）葡萄糖异构酶酶的基本性的基本性的基本性的基本性质质￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿葡葡萄萄糖糖异异构构酶酶能能催催化化D-D-葡葡萄萄糖糖异异构构化化生生成成D-D-果果糖糖，，也也可可将将木木聚聚糖糖异异构构化化为为木木酮酮糖糖，，此此外外还还能能以以D-D-核核糖糖、、L-L-阿阿拉拉伯伯糖糖、、L-L-鼠鼠李李糖糖及及葡葡萄萄糖糖3 3、、5 5、、6 6碳碳的的修修饰饰衍衍生生物物为为催催化化底底物物，，但但是是它它只只能能催催化化D-D-葡葡萄萄糖糖或或D-D-木木糖糖的的α-α-旋旋光光异异构构体体，，而不能催化而不能催化β-β-旋光异构体旋光异构体￿￿￿￿￿￿￿￿葡萄糖异构葡萄糖异构酶酶的最适温度一般在的最适温度一般在70-80℃70-80℃，最适，微偏，最适，微偏碱性，不同种属来源的碱性，不同种属来源的酶酶有一定的差有一定的差别别。

葡萄糖异构葡萄糖异构酶酶的的最适温度、最适最适温度、最适pHpH值值及及稳稳定性定性还还受到受到缓缓冲液种冲液种类类、底物、底物浓浓度、激活度、激活剂剂、、稳稳定定剂剂及反及反应时间应时间的影响另外二价金属离的影响另外二价金属离子子对酶对酶活力、活力、稳稳定性及定性及酶酶的的专专一性都有影响一性都有影响 ￿￿￿￿￿￿￿￿各种属来源的葡萄糖异构各种属来源的葡萄糖异构酶酶在在结结构上都有一定的相似构上都有一定的相似性其一级结级结构的同源性随种属关系构的同源性随种属关系远远近不同而不同但近不同而不同但有有4040个恒定氨基酸残基，其中包括个恒定氨基酸残基，其中包括1414个残基与个残基与酶酶活性中心活性中心有关葡萄糖异构有关葡萄糖异构酶酶晶体的空晶体的空间结间结构一般都是构一般都是紧紧密的四聚密的四聚体，体，单单体相体相对对分子分子质质量量约约4 4万万-5-5万，万，单单体体间间符合符合222222点点对对称称分布单单体由一大一小两个体由一大一小两个结结构域构成，近构域构成，近N N端的主端的主结结构构域是由域是由8 8股右手的股右手的α/βα/β型桶构成，两个同型桶构成，两个同轴圆轴圆柱中，内柱柱中，内柱由由8 8条平行的条平行的β-β-折叠股构成，外柱由折叠股构成，外柱由8 8股与股与β-β-折叠交替相折叠交替相邻邻α-α-的螺旋构成的螺旋构成,￿α-,￿α-螺旋与螺旋与β-β-折叠构成反平行；折叠构成反平行；C C端的端的小小结结构域由几段构域由几段α-α-螺旋无螺旋无规则规则卷曲成一个卷曲成一个远远离离N N端的端的环环状状结结构，参与构，参与单单体内的相互作用及活性部位的构成（体内的相互作用及活性部位的构成（图图）。

￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿葡葡萄萄糖糖异异构构酶酶的的活活性性中中心心位位于于每每个个单单体体平平行行ββ桶桶近近C C端端的的口口部部，，是是深深陷陷的的口口袋袋状状，，有有两两个个二二价价金金属属离离子子结结合合位位点点，，与与保保守守的的氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链基基团团以以及及溶溶剂剂中中的的氧氧原原子子形形成成配配位位键键，，周周围围有有一一个个高高度度疏疏水水背背景景区区，，构构成成的的氨氨基基酸酸侧侧链链不不只只由由一一个个单单体体提提供供，，两两个个单单体体相相聚聚成成无无活活性性或或活活性性微微弱弱的的二二聚聚体体，，只只有有形形成成四四聚聚体体时时才才具具有有全全部部酶酶活活葡葡萄萄糖糖异异构构酶酶的的催催化化作作用用采采用用的的是是金金属属离离子子介介导导的的负负氢氢离离子子转转移移机制（机制（图图）￿￿￿￿￿￿￿￿葡萄糖异构葡萄糖异构酶酶的基因的基因组织组织和和调调控主要是由木糖操控主要是由木糖操纵纵子子控制由木糖透性控制由木糖透性酶酶基因（基因（xyltxylt）、木糖异构）、木糖异构酶酶基因基因（（xylaxyla）、木糖激）、木糖激酶酶基因（基因（xylbxylb）和）和调节调节基因（基因（xylrxylr）构）构成木糖操成木糖操纵纵子的主要成分。

子的主要成分 （二）葡萄糖异构（二）葡萄糖异构（二）葡萄糖异构（二）葡萄糖异构酶酶的蛋白的蛋白的蛋白的蛋白质质工程工程工程工程￿ ￿￿￿￿￿￿￿￿￿直接直接发发酵生酵生产产的的GIGI应应用在工用在工业业生生产产中，已中，已经经取得了令取得了令人瞩目的成功，但仍存在一定局限性，如最适人瞩目的成功，但仍存在一定局限性，如最适pHpH值为值为碱性、碱性、高温下高温下稳稳定性定性还还有待提高等偏碱性条件下糖不有待提高等偏碱性条件下糖不稳稳定易焦定易焦化，使化，使总产总产率下降；高温条件有利于反率下降；高温条件有利于反应进应进程的加快和平程的加快和平衡点的向果糖方向移衡点的向果糖方向移动动，因此，因此对对GIGI进进行定向改造成行定向改造成为为客客观观迫切的需求，而蛋白迫切的需求，而蛋白质质工程技工程技术术，可在研究，可在研究GIGI结结构－功能构－功能关系的基关系的基础础上，通上，通过对过对某些氨基酸的替代和修某些氨基酸的替代和修饰饰，改，改变变GIGI的的结结构性构性质质，改善其工，改善其工业应业应用性能 表表6-1￿SM6-1￿SM10331033葡萄糖异构葡萄糖异构酶酶定点突定点突变变及其性及其性质质 突突 变变 性性 质质 K K253253R R 热稳定性小于野生型，比活是野生型热稳定性小于野生型，比活是野生型1.51.5倍倍N N184184V V 比活和热稳定性远低于野生型比活和热稳定性远低于野生型 N N184184D D 最适最适pHpH值下降了值下降了1 1个单位，个单位，pIpI下降了下降了0.60.6个单位，酶活为野个单位，酶活为野生型的生型的38.27% 38.27% A A198198C C 最适温度升高最适温度升高8℃8℃，酶活为野生型的，酶活为野生型的86.95% 86.95% Q Q2020L L 最适反应温度下降最适反应温度下降5℃5℃，热稳定性为野生型的，热稳定性为野生型的78%78%，对底物，对底物亲和性增强亲和性增强 G G247247D D 酶活提高酶活提高33%33%，最适，最适pHpH值下降值下降0.60.6个单位，热稳定性降低个单位，热稳定性降低 G G138138P P 热热稳稳定定性性比比野野生生型型提提高高一一倍倍，，最最适适温温度度提提高高10-12℃10-12℃，，比比活与野生型相当活与野生型相当G G138138P/ P/ G G247247D D 酶活比野生型提高酶活比野生型提高45%45%，，80℃80℃时比时比G G138138P P更稳定更稳定 ￿￿￿￿￿￿￿￿通通过过分析比分析比较较已知的其他种属已知的其他种属GIGI氨基酸序列氨基酸序列发现发现，除，除高温嗜高温嗜热热菌外，菌外，该该同源位置氨基酸均同源位置氨基酸均同源位置氨基酸均同源位置氨基酸均为为GlyGlyGlyGly，而，而嗜嗜嗜嗜热热高温高温高温高温菌同源性部位菌同源性部位菌同源性部位菌同源性部位则为则为ProProProPro，恰恰是它的，恰恰是它的热稳热稳定性和最适反定性和最适反应应温度都是最高。

温度都是最高ProPro较较小的小的转动转动自由度以及自由度以及刚刚性的吡咯性的吡咯烷烷环环使得使得β-β-转转角或无角或无规规卷曲卷曲结结构更加构更加稳稳定，从而定，从而稳稳定整个定整个蛋白蛋白质质的空的空间结间结构，提高蛋白构，提高蛋白质质的的热稳热稳定性这这一一现现象在象在其他多种其他多种酶酶中都能中都能发现发现，如，如1,6-1,6-寡葡糖苷寡葡糖苷酶酶、、TrpTrp合成合成酶酶、、鸡鸡腺苷酸激腺苷酸激酶酶等在蛋白等在蛋白质质工程中，用工程中，用ProPro替代其他氨基替代其他氨基酸（酸（X-aa→ProX-aa→Pro）也有）也有许许多多应应用，如用，如T T4 4噬菌体溶菌噬菌体溶菌酶酶、、丝丝氨酸蛋白水解氨酸蛋白水解酶酶、中性蛋白、中性蛋白酶酶等 ￿￿￿￿￿￿￿￿葡萄糖异构葡萄糖异构酶酶的定点突的定点突变变蛋白蛋白质质工程工程对酶对酶的的专专一性也一性也有影响，表有影响，表6-26-2列出了一些突列出了一些突变变体体酶对酶对葡萄糖和木糖的催葡萄糖和木糖的催化常数由表中可化常数由表中可见见野生型的野生型的GIGI对对木糖的催化作用比木糖的催化作用比对对葡葡萄糖大，不同的突萄糖大，不同的突变酶变酶其其酶酶的的选择选择性不同，双突性不同，双突变变W W139139F F／／V V186186T T和和W W139139F F／／V V186186S S的的酶酶底物底物专专一性均有利于葡萄糖的异构一性均有利于葡萄糖的异构化反化反应应。

表表6-2￿6-2￿定点突定点突变对变对GIGI底物底物专专一性的影响一性的影响 突变酶突变酶 Kcat/Km(minKcat/Km(min-1-1nMnM-1-1) ) 葡萄糖葡萄糖 木糖木糖 野生型野生型5.85.897.297.2W W139139Y Y 6.0 6.0 3.23.2W W139139F F 1.5 1.5 13.613.6V V186186T T 9.7 9.7 55.455.4V V186186S S 5.7 5.7 15.915.9W W139139F/ VF/ V186186T T 32.9 32.9 21.621.6W W139139F/ VF/ V186186S S 12.4 12.4 4.0 4.0 二、凝乳二、凝乳二、凝乳二、凝乳酶酶 ￿￿￿￿￿￿￿￿凝乳凝乳酶酶（（chymosinchymosin）是利用生物工程技）是利用生物工程技术发术发酵生酵生产产的的食品工食品工业业用用酶酶之一，早在之一，早在19901990年就已年就已获获美国美国FDAFDA批准用于干批准用于干酪生酪生产产，且符合，且符合GRASGRAS（（Generally￿Recognized￿as￿SafeGenerally￿Recognized￿as￿Safe））标标准，无需准，无需标标示。

凝乳示凝乳酶酶也是研究蛋白也是研究蛋白质结质结构修构修饰饰与功能与功能之之间间关系的良好材料关系的良好材料￿ ￿￿￿￿￿￿￿￿￿凝乳凝乳酶酶的蛋白的蛋白质质工程主要集中在工程主要集中在对对二硫二硫键键的研究上的研究上不同来源的凝乳不同来源的凝乳酶酶有不同数目的二硫有不同数目的二硫键键牛凝乳酶酶含有三含有三对对，米黑毛霉含有两列，寄生内座壳菌只有一，米黑毛霉含有两列，寄生内座壳菌只有一对对因此不同二硫同二硫键键在凝乳在凝乳酶酶中中对酶对酶活性的影响是不同的，利用蛋白活性的影响是不同的，利用蛋白质质工程中的定点突工程中的定点突变变技技术术可以了解二硫可以了解二硫键键在在结结构、功能中构、功能中的作用 三、其他分子蛋白三、其他分子蛋白三、其他分子蛋白三、其他分子蛋白质质工程工程工程工程（一）胰（一）胰（一）胰（一）胰岛岛素的蛋白素的蛋白素的蛋白素的蛋白质质工程工程工程工程 胰胰岛岛素是一种蛋白素是一种蛋白质质激素，是治激素，是治疗疗糖尿病的特效糖尿病的特效药药，，具有重要医用价具有重要医用价值值天然胰岛岛素用于素用于临临床有一些重要缺床有一些重要缺点，包括作用点，包括作用时时效短、效短、进进入血流入血流缓缓慢、慢、长长期使用期使用产产生抗生抗性、性、长长期保存易期保存易变变性、供性、供应应短缺等。

通短缺等通过对过对胰胰岛岛素的蛋素的蛋白白质质工程研究，可以工程研究，可以获获得上列缺点得到改善的新型胰得上列缺点得到改善的新型胰岛岛素制素制剂剂￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿我我国国的的相相关关研研究究人人员员密密切切合合作作，，取取得得下下列列一一系系列列研研究究结结果 1.1.改改造造胰胰岛岛素素原原连连接接肽肽（（C C肽肽）），，从从3030几几个个氨氨基基酸酸缩缩短短为为3 3个个氨氨基基酸酸，，获获得得基基因因工工程程生生产产胰胰岛岛素素的的高高效效表表达达，，已已进进入中入中试试，并，并获获得国家得国家专专利￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿2.2.依依据据药药用用胰胰岛岛素素制制剂剂的的精精细细结结构构，，提提出出增增加加次次级级键键、、稳稳化化寡寡聚聚体体以以获获得得长长效效胰胰岛岛素素的的原原理理，，通通过过定定向向分分子子设设计计获获得得2 2种种目目标标产产品品，，作作用用时时效效延延长长8-12h8-12h在在nmnm分分辨辨率率测测定定目目标标产产品品的的晶晶体体结结构构，，证证实实分分子子设设计计原原理理的的正正确确性性首首次次在在国国内内成成功功地地实实现现从从预预定定性性能能→→分分子子设设计计→→目目标标产产品品制制备备→→改改性性产产品品的的结结构构测测定定的的蛋蛋白白质质工工程程全全循循环环，，为为进进一一步步的的研研究究奠奠定定了了基基础础，提供了，提供了经验经验。

￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿3.3.以以速速效效和和高高效效胰胰岛岛素素为为中中心心，，完完成成定定向向分分子子设设计计1212种种，，获获得得4 4种目种目标产标产品，成功地达到品，成功地达到预预期目期目标标￿￿￿￿4.￿￿￿￿4.建立了工程化胰建立了工程化胰岛岛索索结结构一功能研究的多种系列，包构一功能研究的多种系列，包括括长长效、速效、高效、高效、速效、高效、高稳稳定、低免疫等改性胰定、低免疫等改性胰岛岛素，形成素，形成了一个比了一个比较较系系统统的多方位研究格局，的多方位研究格局，为为我国胰我国胰岛岛素蛋白素蛋白质质工工程的程的进进一步一步发发展、展、创创新和新和临临床床应应用提供了充分条件用提供了充分条件 （二）胰蛋白（二）胰蛋白（二）胰蛋白（二）胰蛋白酶酶抑制抑制抑制抑制剂剂￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿通通过过蛋蛋白白质质工工程程途途径径研研究究慈慈姑姑双双头头蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂和和南南瓜瓜族族的的天天花花粉粉蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂的的结结构构与与功功能能，，取取得得显显著著成成绩绩￿￿￿￿1.￿￿￿￿1.确确认认抑制抑制剂剂的活性中心和二硫的活性中心和二硫键键的作用￿￿￿￿2.￿￿￿￿2.改改变变抑制抑制剂剂的的专专一性，确一性，确认专认专一性相关残基。

一性相关残基￿￿￿￿（三）枯草杆菌蛋白（三）枯草杆菌蛋白（三）枯草杆菌蛋白（三）枯草杆菌蛋白酶酶￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿枯枯草草杆杆菌菌蛋蛋白白酶酶是是广广泛泛用用于于洗洗涤涤剂剂工工业业中中的的一一种种重重要要酶酶蛋蛋白白质质工工程程的的主主要要目目的的是是通通过过酶酶分分子子改改造造获获得得抗抗氧氧化化、、稳稳定定性性并并能能高高表表达达的的碱碱性性蛋蛋白白酶酶经经过过几几年年的的努努力力，，已已获获得很好的得很好的结结果MetMet222222AlaAla、、GlnGln103103ArgArg、、AspAsp6060AsnAsn，，使使碱碱性性蛋蛋白白酶酶抗抗氧氧化化性性达达到到95%95%以上，并提高以上，并提高酶酶的比活的比活2-32-3倍PCRPCR法法对对蛋蛋白白酶酶基基因因进进行行随随机机突突变变，，通通过过表表型型筛筛选选得得到到热热稳稳定定的的碱碱性性蛋蛋白白酶酶，，热热失失活活半半衰衰期期比比野野生生型型延延长长3-63-6倍倍在在65℃65℃的的高高温温下下，，半半失失活活时时间间长长达达82min82min由由此此获获得得了了既既抗抗氧氧化化又又耐耐热热的的碱碱性性蛋蛋白白酶酶。

热热稳稳定定的的碱碱性性蛋蛋白白酶酶基基因因的的DNADNA序序列列测测定定发发现现，，突突变变AsnAsn118118SerSer是是热热稳稳定定性性增增加加的的主主要要原原因因，，这这一一结结果果迄迄今今尚尚未未见见有有报报道道这这不不仅仅对对该该酶酶应应用用范范围围的的扩扩大大具具有有意意义义，，而而且且对对其其结结构构一一功功能能关关系系提提供供了了新新的的了了解解这这一研究一研究结结果已果已经获经获得国家得国家专专利（四）天花粉蛋白的蛋白（四）天花粉蛋白的蛋白（四）天花粉蛋白的蛋白（四）天花粉蛋白的蛋白质质工程工程工程工程￿￿￿￿￿￿￿￿天花粉蛋白（天花粉蛋白（trichosanthintrichosanthin，，TCSTCS）是从括楼）是从括楼块块根中根中分离分离纯纯化的一种活性蛋白，属化的一种活性蛋白，属ⅠⅠ型核糖体失活蛋白型核糖体失活蛋白TCSTCS最早用于中期引最早用于中期引产产，，对对治治疗恶疗恶性葡萄胎、滋养性葡萄胎、滋养层细层细胞疾病胞疾病等有等有较较好好疗疗效它还还有广有广谱谱的抗病毒作用，能抑制人艾滋的抗病毒作用，能抑制人艾滋病病毒（病病毒（HIV-1HIV-1）在受感染）在受感染细细胞中的复制，可望用作抗艾胞中的复制，可望用作抗艾滋病滋病药药物。

但天花粉蛋白作物但天花粉蛋白作为为外源毒蛋白，在体内引起免外源毒蛋白，在体内引起免疫疫应应答，答，导导致致过过敏反敏反应应蛋白质质工程工程试图试图通通过对过对TCSTCS进进行行结结构与功能的改造，降低构与功能的改造，降低TCSTCS的免疫原性的免疫原性 ￿ ￿￿ ￿￿ ￿￿ ￿已已经经通通过过测测定定突突变变体体蛋蛋白白与与单单抗抗TETTET结结合合能能力力的的改改变变，，发发现现在在残残基基173-177173-177之之间间的的突突变变体体明明显显降降低低了了与与单单抗抗TETTET的的结结合合能能力力，，从从而而推推测测173-177173-177位位残残基基附附近近可可能能是是单单抗抗TETTET的的结结合合部部位位同同时时，，对对于于活活性性部部位位附附近近具具有有恒恒定定氢氢键键并并在在一一级级结结构构上上保保守守的的残残基基进进行行了了定定位位诱诱变变试试验验，，以以了了解解它它们们对对活活性性部部位位构构象象及及生生物物活活性性的的影影响响，，对对这这些些突突变变体体生生物物活活性性及及酶酶动动力力学学测测试试表表明明，，它它们们与与野野生生型型相相比比变变化化不不大大。

对对突突变变体体Q Q156156A A和和R R2222L L的的晶晶体体结结构构测测定定显显示示，，虽虽然然突突变变残残基基与与天天然然残残基基显显著著不不同同，，但但TCSTCS分分子子活活性性部部位位的的构构象象基基本本上上保保持持不不变变这这为为进进一一步步的的分分子子设设计计提提供供了了参参考考信信息息，，即即某某些些活活性部位的保守残基也是可替性部位的保守残基也是可替换换的 （五）溶菌（五）溶菌（五）溶菌（五）溶菌酶酶￿￿￿￿￿￿￿￿溶菌溶菌酶酶的蛋白的蛋白质质工程主要工程主要应应用于用于““工程二硫工程二硫键键””提高提高该酶该酶的的热稳热稳定性方面，以定性方面，以T T4 4溶菌溶菌酶酶的研究的研究较为较为深入￿￿￿￿￿￿￿￿晶体晶体结结构研究表明，构研究表明，T T4 4溶菌溶菌酶酶分子含一条分子含一条肽链肽链，并折，并折叠形成两个在空叠形成两个在空间间上相上相对对独立的独立的结结构域，活性中心位于两构域，活性中心位于两个个结结构域之构域之间间该该分子含分子含9797位和位和5454位两个未形成二硫位两个未形成二硫键键的的半胱氨酸，即野生型半胱氨酸，即野生型酶酶不含二硫不含二硫键键。

二硫二硫键键是是稳稳定分子空定分子空间结间结构最重要的一种共价构最重要的一种共价键键，它能将分子牢固的，它能将分子牢固的联联接在一接在一起，因此它能提高起，因此它能提高酶酶的的热稳热稳定性￿￿￿￿Perry￿￿￿￿Perry对对溶菌溶菌酶酶空空间结间结构仔构仔细细分析并提出分析并提出对对其其热稳热稳定性定性改善改善设计设计方案采取通方案采取通过过定位突定位突变变，使溶菌，使溶菌酶酶半衰期由原半衰期由原来来11min11min提高到提高到6h6h如果同时时用碘乙酸封用碘乙酸封闭闭余下的第余下的第5454位位CysCys或将其突或将其突变为变为ThrThr或或ValVal，，则则同同时时提高提高该酶该酶的抗氧化活力的抗氧化活力新引入的新引入的““工程二硫工程二硫键键””稳稳定了两个定了两个结结构域的相构域的相对对位置，位置，从而从而稳稳定了由两个定了由两个结结构域所形成的活性中心构域所形成的活性中心 （六）蛋白（六）蛋白（六）蛋白（六）蛋白质质分子分子分子分子设计设计及其新方法研究及其新方法研究及其新方法研究及其新方法研究￿￿￿￿￿￿￿￿我国在研究和我国在研究和发发展蛋白展蛋白质质分子分子设计设计及其定量方法方面，及其定量方法方面，取得了一系列具有取得了一系列具有创创新意新意义义的成果：的成果：￿￿￿￿1.￿￿￿￿1.酶酶与底物、与底物、药药物与受体物与受体结结合自由能及合自由能及稳稳定性的定性的计计算算机模机模拟拟。

￿ ￿￿￿￿￿2.￿￿￿￿2.蛋白蛋白质质及其周及其周围围溶溶剂剂的静的静电电相互作用的相互作用的计计算机模算机模拟拟￿ ￿￿￿￿￿3.￿￿￿￿3.多多肽肽及蛋白及蛋白质质的随机的随机动动力学模力学模拟拟 （七）蛋白（七）蛋白（七）蛋白（七）蛋白质结质结构构构构预测预测和模型构建和模型构建和模型构建和模型构建￿￿￿￿￿￿￿￿蛋白蛋白质质工程研究中建立了以神工程研究中建立了以神经经网网络计络计算算预测预测蛋白蛋白质质二二级结级结构的方法，取得成功率构的方法，取得成功率优优于于60%60%的好成的好成绩绩，并，并进进一步一步运用运用简简化的二化的二态态蛋白蛋白质质分子能量函数分子能量函数预测预测同源蛋白的三同源蛋白的三级级结结构，构，预测预测精度（精度（预测结预测结构与构与实验测实验测定定结结构构CaCa原子位置原子位置间间的均方根差）可的均方根差）可优优于于1nm1nm对对于同源性于同源性较较差（在差（在30%-60%30%-60%之之间间）的蛋白）的蛋白质质，运用改，运用改进进的四的四态态能量函数，也取得了良好能量函数，也取得了良好效果在改效果在改进进同源蛋白同源蛋白质质模型建造方法的基模型建造方法的基础础上，上，还还建立建立了一套蛋白了一套蛋白质质三三维结维结构的同源模型建造（构的同源模型建造（modelingmodeling））计计算算机机软软件件PMODELINGPMODELING。

思考题思考题 1.1.蛋白蛋白质质工程的原理？工程的原理？￿ ￿￿￿2.￿￿2.蛋白蛋白质质工程的主要研究方法有哪些？工程的主要研究方法有哪些？￿ ￿￿￿3.￿￿3.举举例例说说明蛋白明蛋白质质工程在食品工工程在食品工业业中的中的应应用？用？ 。