EPO对失血性休克合并内毒素血症兔TNFα、IL6、IL10、MDA影响的研究临床医学论文.doc

EPO对失血性休克合并内毒素血症兔TNFα、IL6、IL10、MDA影响的研究_临床医学论文 【摘要】 [目的]观察内毒素血症引起兔脂质过氧化产物、炎症因子水平改变，运用促红细胞生成素(EPO)进行干预[方法]兔股动脉放血造休克随后复苏，予腹腔注射内毒素，两次打击造成兔多脏器功能不全模型;24只健康新西兰大白兔随机分成对照组、二次打击组、EPO组，每组8只;造模前后留取血标本用于检测TNFα、IL6、IL10、MDA等指标[结果]二次打击致其它两组MDA水平明显高于对照组，EPO组MDA水平较二次打击组明显降低;二次打击致其它两组TNFα、IL6、IL10水平明显高于对照组，EPO组明显低于二次打击组[结论]TNFα，IL6，IL10等炎症因子与MDA等脂质过氧化产物参与了失血性休克合并内毒素血症所致多脏器损伤的过程，EPO能降低失血性休克合并内毒素血症兔炎症因子及脂质过氧化产物水平 【关键词】 内毒素血症;促红细胞生成素;多脏器功能不全;炎症因子　　Abstract： [Objective]To explore the rabbits’ lipid peroxidation and cytokine level change caused by endotoxemia，use EPO for intervention.[Method]Bleed rabbits femoral for shock，after coming to，make injection of endotoxin，two beatings make dysfunctional multiorgans model;randomly divide 24 healthy rabbits into control group(1)，2beating group(2)，EPO group(3)，8 in each;take blood for testing indexes of TNFα，IL6，IL10 and MDA.[Result]Group 2 was higher than other groups on MDA level，group 3 less than group 2;group 2 was much higher than other 2 groups on TNFα，IL6 and IL10，group 3 less than group 2.[Conclusion]The cytokines and lipid peroxidation participating in the course of multiorgan injury caused by blood loss shock and endotoxemia can be reduced by EPO.　　Key words： endotoxemia;EPO;dysfunctional multiorgans;cytokines　　严重的内毒素血症引起休克、DIC，甚至多器官功能衰竭(MODS)。

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素，主要由肾脏皮质、髓质交界处的肾小管旁细胞分泌，分子量为30.4kd由于其具有促进造血的作用，在贫血 治疗 领域得到了广泛应用鉴于EPO在细胞保护作用研究上的较大进展以及其抗炎作用的发现，本文设计此实验以观察EPO对失血性休克合并内毒素血症所致炎症因子水平及脂质过氧化产物表达的影响　 　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 新西兰大白兔24只，雌雄不限，每只体重1.9～2.5kg，由浙江省医学 科学 院动物实验中心提供24只新西兰大白兔随机分成3组：对照组 8只，二次打击组 8只，EPO治疗组 8只　　1.2 实验试剂 重组人促红细胞生成素(rhEPO)(山东科兴生物制品有限公司)内毒素试剂(LPS，E.coli，O111B4 )(美国SIGMA公司)丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)兔肿瘤坏死因子酶联免疫分析(TNFα ELISA)试剂盒(美国USCNLIFE公司，产品编号：E0133Rb)兔白细胞介素6酶联免疫分析(IL6ELISA)试剂盒(美国USCNLIFE公司，产品编号：E0079Rb)。

兔白细胞介素10酶联免疫分析(IL10ELISA)试剂盒(美国USCNLIFE公司，产品编号：E0056Rb)　　1.3 实验仪器 Spacelab多功能监护仪(美国Spacelab公司)Axsym全自动发光免疫分析仪(美国Abbott公司)BIORAD酶标仪(日本BIORAD公司)722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)LD42A离心机(北京医用离心机厂)70℃超低温冰箱(美国FORMA公司)HHW21.CU600电热恒温水浴箱(上海医疗器械七厂)MM1型微量振荡器(江苏康泰医疗器械厂)XK95B旋涡混合器(江苏康泰医疗器械厂)　　1.4 动物模型制备 二次打击(失血性休克合并内毒素血症)兔模型制作： 参考 卢瑗瑗等[1]的方法：兔耳缘静脉置留置针，氯氨酮(1.5mg/kg)肌注麻醉，麻醉后固定于手术台;(右股动脉区)股动脉置留置针，接换能器，连接监护仪，监测血压;测压正常后通过股动脉留置针连接三通快速抽出血液(肝素化室温无菌保存)，使兔 MAP降至40mmHg，维持60min，随后回输全部血液及生理盐水使血压恢复至放血前水平，回输时间>30min;复苏后予腹腔注射100ug/kg剂量LPS(E.Coli O111B4)，20ml0.9%NS稀释;通过股静脉留置针于造模前，二次打击后 1h，二次打击后6h，二次打击后24h(处死前)取血标本;实验结束时取兔心肌组织标本，浸泡于10%的中性甲醛液。

　　1.4.1 对照组 分离股动静脉，置管后不予放血，90min后腹腔注射20ml0.9%NS，于置管时及注射NS后 1h、6h、24h(处死前)取血标本，离心后取上清，作CKMB，cTnI，MDA，IL6，IL10，TNFα水平检测;处死兔，取出心脏标本作病理检测　　1.4.2 二次打击组 按步骤制备二次打击兔模型，于造模前，二次打击后 1h、6h、24h(处死前)取血标本，离心后取上清，作CKMB，cTnI，MDA，IL6，IL10，TNFα水平检测;处死兔，取出心脏标本作病理检测　　1.4.3 EPO治疗组 按步骤制备二次打击兔模型，其中第4步在注射LPS结束后，于耳缘静脉注射5000iu/kg剂量EPO，于造模前，二次打击后 1h、6h、24h(处死前)取血标本，离心后取上清，作CKMB，cTnI，MDA，IL6，IL10，TNFα水平检测;处死兔，取出心脏标本作病理检测　　1.5 血清标本制备及保存 将血浆标本室温放置2h后，于3000xg离心10min，取上清收集于锥形瓶中，将标本放于-70℃超低温冰箱保存　　1.6 检测指标及检测方法 血清丙二醛(MDA)含量测定：硫代巴比妥酸(Thibabituric Acid TBA)法。

血清肿瘤坏死因子(TNFα)测定法：双抗体夹心法血清白细胞介素6(IL6)测定法：双抗体夹心法血清白细胞介素10(IL10)测定法：双抗体夹心法　　1.7 统计学处理 本实验所有计量资料均采用均数±标准差表示，数据资料用SPSS for windows 11.0统计软件包处理，采用F检验进行多组间差异的比较，两两比较用q检验　 　2 结果 　　2.1 血清MDA测定 三组兔在造模前的血清MDA水平无明显统计学差异，二次打击组、EPO组兔造模后各时间点血清MDA水平较对照组有明显上升，差异显著(P<0.01)EPO组与对照组相比，造模后1h MDA水平未显示出统计学差异，而在造模后6h、24h时，MDA水平低于二次打击组(P<0.05)详见表1表1 三组兔血清MDA测定结果(x±s，μmol/L)注：与对照组相比：# P<0.01;EPO组与二次打击组比较：▲P<0.05，▲▲ P<0.01 　　2.2 血清TNFα、IL6、IL10测定 三组兔造模前血清TNFα水平未见统计学差异，二次打击组与EPO组造模后各时间点血清TNFα较对照组明显上升(P<0.01)EPO组与二次打击组相比较，造模后1h两组血清TNFα水平未见明显统计学差异，造模后6h，EPO组TNFα水平较二次打击组下降(P<0.05)，24h后下降尤为明显(P<0.01)。

详见表2表2 三组兔血清TNFα测定结果与对照组相比：# P<0.01;EPO组与二次打击组比较：▲P<0.05，▲▲ P<0.01　　三组兔造模前血清IL6水平未见明显统计学差异，造模后二次打击组与EPO组各时间点血清IL6水平较对照组明显上升(P<0.01)EPO组与二次打击组相比较，造模后1h两者IL6水平未见明显统计学差异，造模后6h及24h，EPO组IL6水平较二次打击组下降(P<0.05)详见表3表3 三组兔血清IL6测定结果注：与对照组相比：# P<0.01;EPO组与二次打击组比较：▲P<0.05，▲▲ P<0.01　　三组兔造模前血清IL10水平未见明显统计学差异，造模后二次打击组与EPO组各时间点血清IL10水平较对照组明显上升(P<0.01)EPO组与二次打击组相比较，造模后1h及6h两者IL10水平未见明显统计学差异，造模后24hEPO组IL10水平较二次打击组下降，差异显著(P<0.01)详见表4表4 三组兔血清IL10测定结果(x±s，ng/ml)　　n造模前造模后 1h6h24h对照组80.16±0.020.17±0.010.19±0.020.16±0.01二次打击组80.16±0.010.32±0.03#0.65±0.09#1.02±0.05#EPO组80.15±0.010.31±0.02#0.59±0.04#0.89±0.06▲▲#　　与对照组相比：# P<0.01;EPO组与二次打击组比较：▲P<0.05，▲▲ P<0.01　 　3 讨论 　　内毒素血症是由于大量内毒素进入血液而引起的各种临床症状，多在感染、烧伤、休克等应激状态下出现。

内毒素的生物效应是多方面互相促进或制约的，各种临床症状常是多种生物学效应综合作用的结果虽然人们对内毒素的结构、生物学活性、致病机制以及内毒素血症的病理生理过程等方面的认识取得了显著进展，但是针对内毒素血症的 治疗 却没有很好解决尽管采用了日臻完善的器官支持和重症监护技术，但严重感染及感染性休克的死亡率却一直居高不下　　卞建民等[2]通过实验发现失血性休克加重了以后发生的内毒素血症对宿主的危害性大多实验证明，失血性休克会导致肠道黏膜屏障通透性增加，从而引起内源性细菌或内毒素易位[3]但失血后肠道内毒素易位的程度还与动物种属有关，Jiang 等[3]发现大鼠在失血性休克后30 min可出现肠道细菌易位，90 min时血液中内毒素含量明显上升而Endo 等[4]报告临床病人发生失血性休克后7天血液内毒素水平仍在正常范围失血后宿主网状内皮系统受抑制而导致清除内毒素水平下降卢瑗瑗等通过家兔股动脉放血诱发失血性休克，随后复苏，待血压稳定后，腹腔注射内毒素，成功建立了内毒素血症导致包括心肌损伤在内的多脏器损伤模型本实验参照这一模型，两次打击体现复杂的病理生理过程，内毒素血症刺激机体炎症因子的大量释放损伤各脏器。

　　MDA反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度机体在内毒素作用下，激活氧化系统，抑制抗氧化系统，内毒素诱导MDA参与脏器损伤过程通过试验发现，失血性休克合并内毒素血症导致MDA水平明显增高，而EPO具有抑制MDA生成的作。