《食品生物技术》PPT课件.ppt

木瓜蛋白酶的固定化技术木瓜蛋白酶的固定化技术 木瓜蛋白酶是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质木瓜蛋白酶在医药 食品 日化品等行业方面有着广泛的应用 固定化技术的优点：一、可以做成各种形状，如颗粒状、管状、膜状，装在反应槽中，便于取出，便于连续、反复使用二、稳定性提高，不易失去活性，使用寿命延长三、便于自动化操作，实现用电脑控制的连续生产 采用固定化技术降低了生产成本，下面是对木瓜蛋白酶固定化的研究查阅文章: Ⅰ.壳聚糖载体柔性固定化木瓜蛋白酶 魏荣卿、沈斌等 Ⅱ.微孔淀粉-海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶的研究 金峰 Ⅲ.金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶的研究 刘琳琳、曾力希等一、壳聚糖载体柔性固定化木瓜蛋白酶一、壳聚糖载体柔性固定化木瓜蛋白酶 采用酶柔性固定化模型（在固定化载体上连上有足够长度且亲水的分子链，最后将酶结合到柔性链上），以壳聚糖为载体，双醛淀粉为柔性链，对木瓜蛋白酶进行柔性固定化。

实验材料及仪器：壳聚糖 可溶性淀粉 戊二醛 红外光谱仪 紫外分光光度计 酸度计 恒温震荡仪 试剂：Tris-Hcl缓冲液 酶液（以缓冲液配制）固定化酶的制备流程：固定化酶的制备流程： 以可溶性淀粉为原料制备双醛淀粉 固定化载体的制备（壳聚糖小球 Chitosan-DAS柔性载体 Chitosan-GA手臂载体） 固定化酶的制备（以柔性载体固定 以手臂载体固定） 酶活力的测定固定化条件的优化固定化条件的优化：由试验结果分析知：固定化酶技术使木瓜蛋白酶的活性明显提高由上图可知：固定化木瓜蛋白酶的最优化条件是：固定化温度为24℃，固定化PH是由上图的实验结果知：Chitosan-DAS的固定化效果比Chitosan-GA的效果好即柔性固定比手臂固定效果好同时确定DAS的氧化度为50时最适固定化酶使用次数7～8次活力仍为原活力的一半 固定化处理的时间相同但是载体的不同对酶活力回收率有一定的影响。

由图知：Chitosan-DAS50固定化酶活力回收率比Chitosan-GA要高很多二、微孔淀粉二、微孔淀粉-海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶的研究的研究 采用微孔淀粉-海藻酸钠包埋法固定化木瓜蛋白酶（海藻酸钠与Ca+形成“蛋盒”模式，包埋木瓜蛋白酶） 实验材料与设备：木瓜蛋白酶 微孔淀粉 海藻酸钠 WL500CY高剪切乳化机 PHS-3B型PH计 T-6紫外可见光分光光度计 固定化酶的制备流程固定化酶的制备流程：①将木瓜蛋白酶溶解于去离子水中，加一定量的微孔淀粉混合均匀，充分吸附后高速均质，待用②海藻酸钠+50ml水，加热 溶解+10ml木瓜蛋白酶微孔淀粉混合液，搅拌均匀 用 5号注射器加在一定质量分数的氯化钙溶液中，拉成管状 凝固3min 用蒸馏水洗涤数次，置于冰箱冷藏备用③测定游离酶和固定酶的酶活力结果与分析：由以上三个图知：优化条件为最适微孔淀粉浓度为4%，最适海藻酸钠浓度为3%，最适氯化钙浓度为5.5% 条件 游离酶 固定化酶 PH 6.5 5.7 温度 55℃ 72℃ 稳定性 机械强度增加，稳定性提高 易受其他因素的影响 酶反应动力学3.19mmol/L 2.43mmol/L三、金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶三、金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶的研究的研究 以磁性金属螯合琼脂糖微球为载体，利用金属螯合配体（IDA-Cu+)与蛋白质表面供电子氨基酸相互作用的原理，定向固定了木瓜蛋白酶 实验材料与仪器：木瓜蛋白酶 盐酸半胱氨酸 亚氨基二乙酸 EDTA 四氧化三铁磁流体 琼脂糖 UV751GD型紫外可见光分光光度计 GFU-202C原子吸收分光光度计 85-2型恒温磁力搅拌器 AB204-E型电子分析天平 PB-10型酸度计固定化酶流程：固定化酶流程：载体的制备（磁性琼脂糖微球采用反相悬浮包埋法制备,然后加入IDA，最后加入氯化铜制的琼脂糖-IDA-铜离子螯合载体） 酶的固定化（螯合载体+木瓜蛋白酶室温下震荡4h，用磷酸缓冲液洗涤数次） 测定酶活力 载体的再生（再生载体可对酶再次固定化） 结果与分析： 随着载体吸附铜离子的量的增加，载酶量逐渐增加，固定化酶活在左右出现最高峰后逐渐下降。

 由图可知载酶量受到固定化时间和固定化反应介质PH的影响，最优化条件是固定化4h，反应介质的PH值为7温度、PH对酶活力的影响 由试验结果知：酶的固定化技术使木瓜蛋白酶对PH的耐受力提高一个点，使酶对温度的耐受力提高10℃三种固定化技术的比较：三种固定化技术的比较：相同点相同点：①三种研究均采用了固定化技术达到了共同的目的：提高了木瓜蛋白酶的稳定性，是木瓜蛋白酶可以重复利用，降低了生产成本 ②三种研究酶活的测定方法相同，均采用紫外分光光度法：加入激活剂和磷酸缓冲液以及酪蛋白，37℃反应10min加入三氯乙酸终止酶反应，测定其消光值 ③三种固定化技术均造成酶对底物的亲和力降低：第一篇由于柔性链的作用降低了酶的亲和力；第二篇由于包埋技术，底物要走很长的路径才能与底物结合导致亲和力下降；第三篇由于金属螯合载体的电荷作用导致亲和力下降 不同点： 固定化的原理 第一篇 第二篇 第三篇酶柔性固定化模型 包埋法金属螯合载体 第一篇文章在研究阶段主要关注的是Chitosan-DAS和Chitosan-GA的固定化条件的不同，所以下面来比较后两篇文章的不同。

第二篇文章固定化酶的最适PH值为，与游离酶相比向酸性方向移动； 第三篇文章固定化酶的最适PH值为，与游离酶相比向碱性方向移动 后两篇文章固定化酶的最适温度较游离酶相比均提高一个点，大约80℃左右 酶的操作稳定性 第一篇 第二篇 第三篇使用7-8次后酶活是原固定酶的一半重复使用13次后酶活逐渐降低使用6次后酶活仍保持在75%左右。