文献：烯丙基半胱氨酸.doc

论文题目：烯丙基半胱氨酸的化学合成、药代动力学及其抗动脉粥样硬化作用机理的研究摘要 大蒜(Garlic)又称葫或麝香草，属百合科葱属植物蒜(Allium Sativum L)的鳞茎，是最早作为防治疾病的植物之一其化学成分复杂，现已测出30多种含硫化合物，其中多数原来并不存在于大蒜中完整大蒜中所含大量γ-谷氨酰胺半胱氨酸(γ-Glutamyl cysteine)可被水解和氧化成蒜氨酸(Alliin)将大蒜粉碎、压榨时，蒜氨酸与大蒜中所含蒜酶(Alliinase)相遇而起反应生成蒜辣素(Allicin)蒜辣素不稳定，遇热或有机溶媒降解生成其他化合物大蒜切碎后水蒸气蒸馏时，蒜辣素主要转化为二烯丙基二硫化物，二烯丙基三硫化物大蒜切碎后用植物油或有机溶媒浸泡时，萃取所得主要化合物是乙烯基二硫杂苯类(Vinyldithiins)和蒜烯(Ajoene)同时，γ-谷氨酰胺半胱氨酸能以不同于蒜氨酸／蒜辣素途径转化生成烯丙基半胱氨酸(S-allylcysteine,SAC)目前，国内研究最多的是大蒜素，而大蒜素的命名较为混杂，主要为两种，一为是蒜辣素(Allicin)，另为二烯丙基三硫化物(allitridium)，从而造成药理作用的多样性。

蒜辣素的药理学作用主要为抗菌抗病毒，而二烯丙基三硫化物的药理学作用主要为抗肿瘤，SAC作用则主要为降血脂及抗动脉粥样硬化        SAC的有关研究在国内尚未见报道，国外的报道也有限SAC的化学结构为CH?=CH-CH?-S-CH?-CH(NH?)-COOHSAC为黄白色粉末，能溶于水，微溶于甲醇，其化学性质非常稳定，在大蒜中的含量为0.05％初步人体药动学(三名志愿者，均取4个点，服用含SAC的大蒜粗提物)研究表明，SAC能很快从小肠吸收，但其半衰期超过10小时，排泄时间超过30小时为此，本研究对SAC进行化学合成，然后建立生物样品SAC的测定方法，并据此进行SAC在大鼠体内药代动力学研究，以便为其临床应用和制剂的研究提供参考依据        目前有关SAC药理学研究的报道逐年增多，其主要药理作用为①抗氧化、清除自由基的作用在体外SAC能显著抑制羟自由基和过氧化物的产生在体内能清除由〓(淀粉样β肽)刺激产生的活性氧②降低胆固醇的作用体外实验表明：SAC能显著抑制胆固醇在肝细胞的合成，其抑制率大于40％③抗LDL的氧化作用在体内SAC能对抗由〓引起的脂质过氧化作用在体外Ide等采用CuSO?孵化LDL24小时，硫代巴比妥酸反应物(TBARS)的含量显著增高，表明LDL被氧化。

以此法研究的结果表明：SAC能显著抑制TBARS的形成，而发挥抗LDL氧化作用④抗肿瘤作用SAC能通过降低脂质过氧化和清除自由基的抗氧化作用对抗致癌物质的致癌作用；能阻止DNA加合物的形成及诱导肿瘤细胞的凋亡发挥抗癌作用⑤对细胞中N0的产生具有调节作用体外实验表明，SAC能抑制在脂多糖(LPS)和干扰素γ(IFNγ)刺激的RAW264.7细胞中的核因子kappaB和鼠诱生型NO合酶(iNOS)启动子的活性，从而抑制iNOS mRNA的转录和蛋白质的表达而阻滞N0的产生与此相反，SAC却能显著增加cGMP含量，起着选择性调节作用本实验采用家兔动脉粥样硬化模型，研究了SAC抗动脉粥样硬化的作用以及对血管中VEGF和ICAM-1 mRNA表达的影响；采用大鼠高脂血症模型，研究了SAC对血脂代谢的影响和抗氧化作用，并探讨了SAC对NO浓度和NOS活性的影响，为阐明SAC预防AS的形成提供理论依据        第一部分 烯丙基半胱氨酸的化学合成及其药代动力学研究 SAC是大蒜中主要的水溶性含硫有机化合物和最重要的生物活性成分之一，其含量较低近几年来的药理学研究认为，SAC具有良好的抑制胆固醇在肝脏的合成作用和较强的抗氧化、抗肿瘤作用，且毒性极低。

因此，研究开发SAC制剂具有良好的应用前景本实验设计一条简便的化学合成线路对SAC进行化学合成，并对该化合物的结构进行了鉴定同时建立了检测生物样品SAC浓度的HPLC-荧光法，并对SAC在大鼠经静脉注射和灌胃后的体内过程进行了研究        第一节 S-烯丙基半胱氨酸的化学合成及结构鉴定 本实验设计烯丙基半胱氨酸合成线路以3-溴丙烯和L-半胱氨酸为原料，在碱性条件下一步合成目标化合物并对目标化合物结晶进行熔点、旋光及UV、IR、?HNMR和MS的测定，确证其结构同时采用HPLC-紫外法直接进样以及HPLC-荧光法邻苯二甲醛(0PA)衍生后进样测定其纯度结果显示该化合物的mp219-220℃，〓-13(c2，H?O)；UV：196 nm(H?O)，205 nm(0.1 mmol·L?? HCl)，218 nm(0.1 mmol·L?? Na0H)；IR、?HNMR和MS与文献报道基本一致；SAC得率为70.8％，纯度大于98％SAC的化学合成方法简易可行，得率高        第二节 生物样品S-烯丙基半胱氨酸浓度测定方法的建立 本实验建立测定血清和组织SAC浓度的HPLC-荧光法采用Hypersil ODS2不锈钢分析柱(5 μm，4.6×250 ㎜，ID×L)为固定相，50 mmol·L?? 醋酸盐缓冲液(pH 5.8)：甲醇：乙腈(50:23:28)为流动相；柱温为35℃，荧光检测激发波长为350 nm，发射波长为455 nm；外标法定量。

血清样品的预处理采用甲醇沉淀蛋白后OPA衍生；组织样品的预处理采用甲醇匀浆后OPA衍生在此条件下，血清样品在2-120 ㎎·L?? 浓度范围内，线性关系良好；组织样品在2-120 ㎎·g??浓度范围内，线性关系良好低、中、高三种浓度的绝对萃取回收率为70.9％-83.5％；相对回收率为92.8％-110％；日内、日间相对标准差(RSD)为4.1％-7.7％生物样品SAC对照品OPA衍生物的保留时间为10.5min，与其他化学成分分离良好，不受其他杂质成分的干扰SAC血清样品在室温和冰融状态下48小时内稳定，在冰冻(-20℃)状态下1个月内保持稳定本研究建立的生物样品SAC浓度检测HPLC-荧光分析法，简便、快速、准确、灵敏、选择性强，适合于SAC生物样品中药物浓度的测定及其药代动力学研究        第三节 S-烯丙基半胱氨酸在大鼠体内药代动力学 本实验研究大鼠灌胃给予和静脉注射SAC的药代动力学特征在单次分别灌胃给予25，50和100 ㎎·㎏?? SAC后，不同时间点采取血样；并在单次剂量50 ㎎·㎏??后，不同时间点取组织样品血清或组织样品中SAC的浓度采用HPLC-荧光法检测单次灌胃给予25，50和100 ㎎·㎏?? SAC后，其达峰时间分别为30 min，30 min和30 min；峰浓度分别为24.4 ㎎·L??，56.0 ㎎·L??和100.1㎎·L??；其AUC????值分别为71.1 ㎎·h·L??，170.2 ㎎·h·L??和293.5 ㎎·h·L??；〓值分别为2.6 h，2.5 h和2.7 h。

单次静脉注射25，50和100 ㎎·㎏?? SAC后，其AUC????值分别为73.4 ㎎·h·L??，178.1 ㎎·h·L??和322.6 ㎎·h·L??；〓值分别为2.4 h，2.5 h和2.6 h在剂量为25，50和100 ㎎·㎏??时，其口服绝对生物度分别为96.8％，95.6％和91.O％SAC口服和静脉注射，其组织分布迅速，肾脏峰浓度〓分别为63.8 ㎎·㎏??和65.7 ㎎·㎏??；肝脏〓分别为50.1㎎·㎏??和58.1 ㎎·㎏??；脾脏〓分别为42.2 ㎎·㎏??和43.3 ㎎·㎏??；心脏〓分别为41.6 ㎎·㎏??和43.3 ㎎·㎏??；肺脏〓分别为34.2 ㎎·㎏??和35.1 ㎎·㎏??；脑组织〓分别为24.2 ㎎·㎏??和26.7 ㎎·㎏??上述数据表明，SAC单次灌胃给予大鼠，其体内过程呈线性药代动力学特征SAC口服生物利用度高，其组织分布迅速而广泛，其中肾脏〓最高，其次为肝脏、脾脏、心脏、肺脏和脑组织        第二部分 S-烯丙基半胱氨酸抗动脉粥样硬化作用及其作用机制 第一节 S-烯丙基半胱氨酸对家兔实验性动脉粥样硬化形成的影响 本实验旨在研究SAC对兔实验性动脉粥样硬化的防治作用。

18只雄性大白兔随机分成正常对照组、高脂模型组、SAC药物组喂饲12周后同时处死在主动脉靠近升主动脉上段附近取材，HE染色和苏丹Ⅲ染色制备光镜样本以及扫描电镜和透射电镜样本主动脉壁形态学、主动脉壁组织光镜、透射电镜观察显示SAC能减轻动脉粥样硬化病变程度，减少泡沫细胞层数，明显减少内皮下脂质，显著减轻动脉血管内皮损伤程度表明SAC有抑制动脉粥样硬化形成的作用        第二节 S-烯丙基半胱氨酸对脂质代谢的影响及其抗氧化作用 本实验旨在观察SAC对脂质代谢的影响及其抗氧化作用采用高脂饮食喂养法建立高脂血症大鼠和小鼠模型以SAC不同剂量ig给药后，测定动物血清和肝脏中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度；同时测定了动物血清、肝和肾脏中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)浓度及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性结果显示SAC明显降低TC、TG、LDL-C以及MDA含量，提高HDL-C和GSH的含量及SOD的活性表明SAC具有良好的降脂和抗氧化作用        第三节 S-烯丙基半胱氨酸对高脂血症大鼠体内一氧化氮水平及其酶活性的影响 本实验研究SAC对高脂血症大鼠体内NO的产生及其酶活性的影响。

雄性大鼠随机分成5组，每组6只第一组喂普通饲料，其他各组喂高脂饲料第一和第二组灌服生理盐水，第三、四和第五组分别灌服SAC 25㎎·㎏??、50 ㎎·㎏??和100 ㎎·㎏??连续给药四周后，大鼠禁食12小时后处死，取样测定血清、肝脏和肾脏中NO浓度及一氧化氮合酶(NOS)的活性和血清L-精氨酸含量该研究显示，SAC能抑制高脂血症大鼠血清、肝脏和肾脏组织中NO浓度及诱生型一氧化氮合酶(iNOS)活性；降低血清L-精氨酸浓度显示SAC通过抑制iNOS活性和L-精氨酸浓度而降低血清和组织中NO的浓度这些作用可能在保护组织氧化损伤和动脉粥样硬化形成方面起着重要的药理作用        第四节 S-烯丙基半胱氨酸对高脂血症大鼠体内LPS诱导NO浓度的影响 本实验旨在研究SAC对在高脂血症体内经LPS诱导产生的NO浓度的影响雄性大鼠随机分组，分别喂正常饮食或高脂饮食并给予生理盐水或不同剂量SAC治疗连续处理4周后，大鼠禁食12小时并腹腔注射20 ㎎·㎏??的LPS测定体内NO浓度和NOS的活性研究显示，SAC通过抑制T-NOS和iNOS的活性，降低大鼠血清、肾和肝脏中由LPS诱导产生的NO的浓度。

对高脂血症大鼠而言，SAC同样能降低大鼠血清、肝和肾脏中由LPS诱导产生的NO浓度并下调T-NOS和iNOS活性结果表明SAC通过抑制iNOS活性，降低NO在体内的浓度        第五节 S-烯丙基半胱氨酸对动脉粥样硬化家兔主动脉中VEGF及ICAM-1 mRNA表达的影响 本实验研究SAC对高脂饮食所致家兔动脉粥样硬化主动脉血管中血管内皮生长因子(VEGF)及细胞间粘附分子-1(ICAM-1)mRNA表达的影响18只雄性家兔，随机分成3组，即正常对照组，喂养普通饲料；动脉粥样硬化模型组，喂养高脂饲料；SAC药物组，喂养高脂饲料和ig SAC(25 ㎎·㎏??·d??)连续12周后处死所有实验兔，取主动脉进行RT-PCR实验研究显示正常家兔动脉血管中，仅有少量VEGF和ICAM-1 mRNA表达；动脉粥样硬化模型组家兔动脉血管中VEGF和ICAM-1 mRNA的表达显著增加；而SAC药物组可降低动脉粥样硬。