polβ高表达与食管癌细胞耐药的相关性.docx

polβ高表达与食管癌细胞耐药的相关性 　　DNA聚合酶β； 转染；食管肿瘤；肿瘤细胞，培养的；抗药性，肿瘤；四甲基偶氮唑蓝　　DNA聚合酶beta (polymerase beta gene，polβ)广泛存在于哺乳动物细胞核内，是一条Mr为39×103的单肽链小分子蛋白，由355个氨基酸组成，是目前已知的最小的DNA聚合酶. 在碱基切除修复，DNA复制，跨损伤合成中发挥重要作用，还与基因组不稳定性有关［1-4 ］. 近年来的研究表明在多种肿瘤组织及肿瘤细胞株内polβmRNA的表达都明显增加［5-6］. polβ与肿瘤细胞耐药性的关系也逐渐引起人们的注意. 本实验通过研究人食管癌顺铂(concentration of cisplatin, cDDP)耐药细胞系Ec9706/cDDP和稳定高表达人野生型polβ的Ec9706细胞中polβ的表达水平及其对抗肿瘤药cDDP的敏感性，旨在进一步探讨polβ高表达与食管癌细胞耐药的相关性.　　1材料和方法　　1.1材料　　人食管癌细胞株Ec9706由中国医学科学院肿瘤研究所提供；cDDP山东齐鲁药业股份有限公司产品；RPMI 1640培养液Gibco/ BRL公司生产；四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma产品；pEGFPC3 (Clonetech公司)；野生型人polβ重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFPAC3(微生物学与免疫学教研室赵国强教授惠赠)；G418(宝生物公司)；6TG (美国Sigma公司)；LipofectamineTM 2000（Invitrogen公司）；引物2对，由上海生工公司合成：polβRNA检测引物：上游5′TGTTTGCCAGCTTCCC AGTA3′，下游5′CTCCA GTGACTCCCAAGGGA3′，扩增长度206 bp；βactin引物:上游5′TC AAGATCATTGCTCCTCCTGA3′，下游5′CTCGTCATACTCCTGCTT GCTG 3′，扩增长度113 bp.　　1.2方法　　1.2.1cDDP诱导耐药细胞系Ec9706/cDDP的建立　　采用cDDP中等浓度、间歇作用方法建株. 以终浓度为2 mg/L的cDDP培养基冲击对数生长期的Ec9706细胞，48 h后弃去含药培养基，PBS洗3次，换新鲜培养基. 1～2 d换液1次，洗去死亡细胞，待形成细胞克隆时传代，恢复稳定生长后提高cDDP浓度再次冲击，如此反复作用直至细胞可在浓度为0.5 mg/L的cDDP培养液中维持培养.　　1.2.2稳定高表达人野生型polβ的Ec9706细胞系的建立　　取对数生长期Ec9706细胞以2.5×105个/孔接种于6孔板，待细胞融和度达60%～70%时，以正常Ec9706细胞作对照，分组转染pEGFPC3 (空质粒)和pEGFPAC3，按转染试剂LipofectamineTM 2000操作说明书进行. 4～6 h后，弃转染液换2 mL含10 mL/L胎牛血清的培养液继续培养. 48 h后以含750 mg/L G418的培养液筛选，约14 d后对照Ec9706细胞全部死亡，转染组改用含200 mg/L G418的培养液，阳性克隆扩大培养后，建立稳定传代转染细胞系. 转染pEGFPC3, pEGFPAC3的细胞分别用Ec9706C3, Ec9706AC3表示.　　1.2.3细胞形态学观察普通倒置显微镜下观察各组细胞形态，荧光显微镜观察转染后细胞绿色荧光.　　1.2.4RTPCR检测polβ mRNA的表达取细胞各1瓶，按Trizol试剂盒说明书抽提细胞总RNA，逆转录后PCR扩增. PCR反应体系30 μL： 10×buffer3 μL，dNTP 2.4 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq酶0.5 U，逆转录产物5 μL. PCR反应条件: 94℃预变性5 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，35个循环后，72℃延伸5 min. 15 g/L琼脂糖凝胶电泳. SYNGENE凝胶分析系统软件分析电泳结果，用polβ与β actin积分吸光度值的比值表示polβ基因的相对表达水平.　　1.2.5MTT法测细胞对cDDP敏感性的变化常规MTT法检测，酶标仪以波长550 nm测各孔A值，计算相对抑制率（％）＝（1-加药孔A值/对照孔A值）×100％，用IC50计算器软件计算50%细胞生长抑制所需的药物浓度( IC50)，耐药指数(RI) =待测细胞IC50/ Ec9706细胞IC50.　　统计学处理： 用SPSS 10.0统计软件处理数据，数据以x±s表示，t检验，α=0.05.　　2结果　　2.1各组细胞形态　　经过9 mo的体外诱导筛选获得了在含0.5 mg/L的cDDP培养液中生长良好的耐药细胞系Ec9706/cDDP. 诱导过程中在加入cDDP后24 h倒置显微镜下可见大部分细胞因死亡而漂浮起来，培养液略浑浊，残留贴壁细胞发生明显改变，大小不均匀，有巨细胞产生，形态不规则，细胞突起及部分细胞质中黑色颗粒较多，生长缓慢，于20 d左右可形成细胞克隆，传代后逐渐接近原来细胞形状（图1）. 此外，倒置显微镜下观察转染前后细胞形态无明显差异，均呈多角形或圆形；在荧光显微镜488 nm波长下Ec9706AC3与Ec9706C3细胞呈现绿色荧光，而对照Ec9706细胞则无荧光.　　2.2RTPCR结果　　耐药细胞Ec9706/cDDP与亲本细胞RTPCR后电泳结果见图2. 经灰度扫描后两种细胞内polβ mRNA与βactin相比其相对表达水平分别为0.49±0.09，0.81±0.16，Ec9706/cDDP中polβ的表达高于亲本细胞（P0.05）. A: 正常不加药的Ec9706细胞；B: 加药后24 h细胞；C: 加药后20 d左右形成的克隆；D: Ec9706/cDDP细胞.。