呼吸道合胞病毒建立哮喘动物模型中气道胆碱能神经的分布医学论文.doc

呼吸道合胞病毒建立哮喘动物模型中气道胆碱能神经的分布_医学论文 【摘要】 目的： 用呼吸道合胞病毒(RSV)诱发豚鼠哮喘模型，通过检测气道反应性和气道平滑肌层胆碱能神经分布变化，研究神经机制在哮喘发病中的作用. 方法： 34只豚鼠随机分为4组：Hep2滴鼻＋生理盐水（NS）雾化 (Hep2/NS) 组，RSV滴鼻＋NS雾化 (RSV/NS) 组，Hep2滴鼻＋鸡卵白蛋白（OVA）雾化 (Hep2/OVA) 组和RSV滴鼻＋OVA雾化 (RSV/OVA) 组，其中Hep2/NS组和RSV/NS组动物各9只，Hep2/OVA和RSV/OVA组动物各8只，以Hep2/NS组为对照组. 电刺激迷走神经法检测气道反应性，计数气管粘膜和粘膜下嗜酸性粒细胞(Eos)，行胆碱能神经纤维免疫组化并计数阳性纤维数目. 结果：气道内压力(IP)： RSV/NS组与Hep2/NS组之间差异无统计学意义(P>0.05)，Hep2/OVA组IP明显高于Hep2/NS组和RSV/NS组 (P均<0.05)， RSV/OVA组 IP明显高于Hep2/OVA组 (P<0.01)；Eos：Hep2/NS组与RSV/NS组之间差异无统计学意义(P>0.05)，Hep2/OVA组高于Hep2/NS组和RSV/NS组 (P均<0.05)，RSV/OVA组明显高于Hep2/OVA组 (P<0.01)；平滑肌层有胆碱能阳性纤维分布：RSV/NS组与Hep2/NS组之间差异无统计学意义(P>0.05)，Hep2/OVA组阳性纤维数目明显高于Hep2/NS组和RSV/NS组(P<0.01)，但RSV/OVA组与Hep2/OVA组之间差异无统计学意义(P>0.05). 结论： ① RSV感染可促进OVA引起的豚鼠AHR发生；② OVA可导致气道平滑肌层胆碱能阳性纤维分布增多，但RSV对其增多无明显影响. 【关键词】 呼吸道合胞病毒；哮喘；支气管高反应性；嗜酸细胞；胆碱能纤维　　哮喘是困扰人类呼吸道健康的主要疾病之一，其发病机制错综复杂，至今尚未明确. 目前，大量调查研究证实呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)感染可诱发哮喘［1］. 动物实验中也发现，呼吸道RSV感染后给予鸡卵白蛋白(ovalbumin, OVA)雾化吸入，可导致小鼠发生明显的气道高反应性、肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞(eosinophils, Eos)数目增多等表现［2］，气道反应性主要受气道胆碱能神经的支配. 本实验中我们尝试以RSV感染结合OVA雾化吸人，复制哮喘豚鼠模型，通过研究气道胆碱能阳性神经纤维的分布状况，探索RSV感染诱发哮喘的神经机制.　　 1材料和方法 　　1.1材料　　雌性豚鼠34只，体质量250～300 g (由第四军医大学实验动物中心提供)；RSV Long株A型和Hep2细胞(西京 医院 儿科实验室惠赠)；RPMI 1640(美国GIBCO公司)；胎牛血清(甘肃民海生物工程有限公司)； OVA，II级(美国Sigma公司)；ChAT试剂盒(美国 Chemicon公司)；超声波细胞粉碎机JY92－II(宁波新芝科技股份有限公司)；二道生理记录仪(甘肃国营永红器材厂)；动物呼吸机(浙江医科大学医学仪器实验厂).　　1.2方法　　1.2.1病毒培养　　RSV接种于Hep2单细胞层，以含20 g/L胎牛血清的RPMI 1640为培养液， 37℃, 50 mL/L CO2孵育、传代至75%以上的细胞发生病变. 收集细胞，低温超声破碎细胞，4℃条件下离心10 000 g, 10 min，收集上清，分成4份，-20℃冻存备用.　　1.2.2动物分组及制模　　34只豚鼠随机分为4组：Hep2滴鼻＋生理盐水(normal saline, NS)雾化 (Hep2/NS) 组，RSV滴鼻＋NS雾化 (RSV/NS) 组，Hep2滴鼻＋OVA雾化 (Hep2/OVA) 组和RSV滴鼻＋OVA雾化 (RSV/OVA) 组， 其中Hep2/NS和RSV/NS组动物各9只，Hep2/OVA和RSV/OVA组动物各8只，以Hep2/NS组作为对照组. 乙醚吸入麻醉下给予Hep2细胞培养液或RSV悬液250 mL滴鼻吸入，第2日相同剂量加强1次. 第7日开始给予1 g/mL OVA或者NS隔天雾化吸入，每次30 min，持续2 wk. 第4日各取Hep2/NS组和RSV/NS组豚鼠1只，心脏注射空气致死，无菌条件下取肺组织，均浆，接种于Hep2细胞，观察细胞变化情况.　　1.2.3气道反应性检测　　感染后第21日，豚鼠以乌拉坦1.8 g/kg腹腔注射麻醉，气管插管，一侧侧孔接压力传感器，经二道生理记录仪记录气道内压力(intraairway pressure, IP)（cmH2O, 1 cmH2O＝0.1 kPa)，另一侧连接动物呼吸机. 参数设置：潮气量10 mL/kg，频率：60次/min，记录IP. 用蚊式止血钳钝性分离双侧迷走神经约1 cm，结扎，剪断，浸入石蜡油以免坏死，远端置于保护电极上，连接电刺激器. 参数设置：频率2～25 Hz，脉冲宽度0.20 ms，幅度10 V，每段刺激时间60 s，间歇时间2 min. 给予电刺激后记录 IP的变化.　　1.2.4 病 理学 观察　　主动脉穿刺，同时剪开右心耳，生理盐水灌注冲洗，取主气管和左肺常规40 g/L甲醛溶液固定，24 h后以300 g/L蔗糖缓冲液置换，冰冻包埋剂包埋，恒冷箱连续切片，片厚16 μm，冷风干燥后，进行 HE染色，400×光镜下随机选10个视野，计数支气管粘膜，粘膜下细胞总数和Eos的数目， 计算 每视野平均数(个/视野).　　1.2.5胆碱能神经免疫组化　　免疫组化按ChAT试剂盒中的操作步骤进行. 切片以 PBS漂洗， 100 g/L正常牛血清中室温孵育15 min，羊抗ChAT (1∶1000) 孵育，4℃过夜，再于驴抗羊血清中室温孵育4 h，然后于1∶200的A，B 混合液孵育2 h，最后用DAB进行成色反应10 min，PBS漂洗，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，DPX封片. 阴性对照组给予抗体稀释液代替一抗，其余同上. 以气管分叉处气道为分析对象，400×光镜下图像分析，随机选取10个视野，测量每个视野下阳性纤维数目(条/视野).　　统计学处理： 采用SPSS 10.0统计软件进行数据分析，各组间比较采用单因素方差分析及LSDt检验，组间方差不齐时，采样秩和检验. P<0.05为差异有统计学意义.　 　2结果 　　2.1感染后症状　　经RSV滴鼻的豚鼠在第3日出现打喷嚏，鼻腔有少量卡他样无色透明分泌物，其肺组织匀浆接种细胞后可观察到细胞发生融合性病变；而用Hep2滴鼻的豚鼠无明显呼吸道异常表现，肺组织匀浆接种细胞后观察细胞也无明显变化.　　2.2气道反应性变化　　给予电刺激后各组IP均呈频率依赖型增高. Hep2/NS组和RSV/NS组之间差异无统计学意义(P>0.05)，Hep2/OVA组IP高于Hep2/NS组和RSV/NS组(P均<0.05)，提示OVA雾化吸入可导致气道反应性增高. RSV/OVA组IP明显高于Hep2/OVA组(P<0.01)，提示RSV感染再给予OVA雾化，可导致明显的气道高反应 (图1). 　　2.3胆碱能神经阳性纤维计数　　每个视野下Hep2/NS组，RSV/NS组，Hep2/OVA组和RSV/OVA组豚鼠气道平滑肌层胆碱能阳性神经纤维分布为：7.20±3.07，6.80±3.29，12.80±3.07和13.80±2.76. 其中Hep2/NS组和RSV/NS组阳性纤维数目差异无统计学意义(P>0.05). Hep2/OVA组阳性纤维数目高于Hep2/NS组和RSV/NS组 (P均<0.01)， 但RSV/OVA组和Hep2/OVA组之间阳性纤维数目差异无统计学意义(P>0.05，图2).　　2.4细胞分类计数　　每个视野下Hep2/NS组，RSV/NS组，Hep2/OVA组和RSV/OVA组豚鼠气道粘膜和粘膜下细胞总数分别为：6.83±0.87，6.55±0.90，9.36±1.14和17.11±1.64； Eos数目分别为：0.88±0.84，1.25±1.04，6.38±2.83和24.00±5.93. 其中Hep2/NS组和RSV/NS组细胞总数和Eos数目差异无统计学意义(P>0.05). Hep2/OVA组细胞总数和Eos数目均明显高于Hep2/NS组和RSV/NS组(P<0.05). RSV/OVA组出现明显的细胞浸润，细胞总数和Eos数均高于Hep2/OVA组，差异具有统计学意义(P<0.01).　 　3讨论 　　近年来，哮喘的发病率和死亡率均有逐年增高趋势，其中病毒感染为主要病因之一. 成人中以鼻病毒感染为主，而婴幼儿中则以呼吸道RSV感染最为常见［3］. 婴幼儿时期感染RSV后可引起喘息、气道高反应性等表现，预示着日后可能出现哮喘［4］. 气道高反应性是哮喘的重要特征，主要受气道胆碱能神经的调控. 气道炎症对胆碱能神经的影响直接导致气道反应性的变化［1］. 直接刺激迷走神经，可以明确气道反应性增高与迷走神经功能亢进有关，避免了气道炎症和其它因素的干扰. RSV感染导致气道高反应性的机制很复杂. 有研究发现RSV急性感染可导致以IFNγ为代表的Th1样细胞因子上调，再次接触过敏原可引起Th1样细胞因子转变为类似哮喘的Th2样细胞因子，IL4，IL5水平上调，而IFNγ下调，提示RSV感染可能通过免疫炎症机制导致气道高反应性，从而诱发哮喘［2，5］. RSV感染同样可引起气道内感觉神经肽分泌失衡，iNANC神经功能抑制，eNANC功能亢进，从而促进气道高反应性的发生［6］. 国内学者通过灭活的呼吸道RSV成功复制了哮喘动物模型，直接证实了RSV感染可以诱发哮喘［7］.　　我们的结果显示，RSV感染末期气道反应性恢复正常，这提示RSV感染引起的气道高反应性为可逆的改变，随着炎症消失而恢复正常水平. 但单纯吸入OVA即引起气道反应性增高，且这种气道高反应性与气道胆碱能神经功能亢进、神经纤维分布增多有关. 在吸入OVA之前感染RSV则进一步加重气道高反应性，提示RSV感染可以促进气道高反应性的发生. 但是值得指出的是， RSV感染并不促进气道胆碱能神经的分布，因此其促进气道高反应性发生的机制不是通过促进气道胆碱能神经分布来实现的，这也为进一步研究RSV诱发哮喘的神经机制提出了新的挑战.【 参考 文献 】 　　［1］林耀广. 现代 哮喘病学［M］. 北京: 中国 协和医科大学出版社, 2004: 75-79.　　［2］Jurgen S, Mika JM, Grzegorz C, et al. Transfer of the enhancing effect of respiratory syncytial virus infection on subsequent allergic airway sensitization by T lymphocytes ［J］. J Immunol, 1999, 163(10):5729-5734.　　［3］李明才, 何韶衡. 病毒感染在诱发和加重哮喘中的作用［J］. 中国呼吸和危重监护杂志, 2003, 2(3): 189-192.　　［4］Piedimonte G, Simoes EA. Respiratory syncytial virus and subsequent asthma: one step closer to unravelling the Gordian knot? ［J］. Eur Respir J, 2002,20(3。