质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNAppt课件.ppt

实验二 质粒的酶切、琼脂糖凝胶电泳分别DNA 1. 实验目的2. 实验原理 3. 实验仪器、资料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论 实验目的 l限制性内切酶切割出目的DNAl了解琼脂糖凝胶电泳的原理l掌握琼脂糖凝胶的制造及进展电泳的方法 实验原理 •利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒DNA•琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的DNA〔如用肉眼察看，可检测到10 ng的DNA〕，且检测的范围很广pBC SK mappBC SK mapl它的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极挪动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中构成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度实验仪器、资料与试剂 〔一〕 仪器 1. 程度式凝胶电泳槽 2. 稳压电泳仪 3. 电炉 4. 紫外检测仪 5. 台式离心机 〔二〕 资料 实验一中提取的质粒DNA和酶切后的质粒DNA 〔三〕〔三〕 试剂 1.限制性内切限制性内切酶 EcoRI，，2. TAE电泳泳缓冲液冲液(50×) 〔〔pH8.0〕〕 Tris 242g 冰醋酸冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA〔〔pH8.0〕〕 100ml 3. 溴化乙溴化乙锭溶液溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶水溶液，室温，棕色瓶或或铝铂纸包装保管。

包装保管 4. 10×DNA样品上品上样缓冲液冲液 5. 琼脂糖脂糖实验步骤酶切体系调制酶切体系如下: (共 20μL) 无菌水 6μL， 质粒 10 μL Buffer K 2μL, EcoR I 1μL, BamH I 1 μL 37℃酶切1.5小时 琼脂糖凝胶制备l1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干 l2. 插好挡板、梳子 l3. 根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶 的容器中〔普通用三角瓶〕，然后参与40ml电泳缓冲液〔1×TAE〕 l4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解 l5. 溶液冷至约60℃时，参与溴化乙锭4 μL (终浓度为0.1 g/l)，悄然摇匀，倒入制胶槽上，检查有无气泡l6. 室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，去除碎胶，将凝胶放入电泳槽中 l7. 参与电泳缓冲液〔1×TAE〕至电泳槽中，使液面高于胶面约1mml 8.在DNA样品中参与2 μL (1/10体积)的10× DNA上样缓冲液(loading buffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底。

l9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中l10.插上导线，翻开电泳仪电源，按照需求调理电压至120V，电泳开场，察看电流情况或电泳槽中负极的铂金丝能否有气泡出现 l11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压〔或电流〕回零，封锁电源，停顿电泳 l12. 取出凝胶，在紫外观测仪上察看电泳结果 l13.. 根据需求切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中，放于4℃保管，以备下周实验用实验结果及讨论l质粒DNA在琼脂糖凝胶中普通为三条带，最前面的条带为超螺旋构型，中间为线型，最后为单链有缺刻的构型l如提取过程中有机械损伤，能够在胶上出现弥散l影响RE(限制性内切酶)活性的主要要素：DNA的纯度；DNA的甲基化程度；温度；缓冲液成分〔DDT，BSA〕等运用3 mg的DNA Marker DL　2,000〔500 ng/条带〕进展1%的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。