植物的快速繁殖和脱病毒技术.docx

第5章植物的快速生殖和脱病毒技术利用离体培育技术，将植物外植体在人工培育基和适宜的条件下进展培育，以在短期内获得大量遗传性全都的个体的方法称为离体快速无性生殖，简称为离体生殖〔in vitro propagation〕、微生殖〔micropropagation〕或快速〔养分〕生殖〔rapid propagation〕由离体无性生殖获得的植株称为试管苗无性系(无性生殖系，克隆〕：由同一外植体或细胞增殖的培育物 一般适用范围：1) 加速难生殖或生殖缓慢植物的生殖.2) 易染病毒植物的脱毒生殖.3) 不能用种子生殖的杂合体园艺作物.4) 需要加速生殖的数量有限的优选单株、良种、珍稀濒危植物，以及生物工程产生的品种.第1节 植物的快速生殖技术1 离体快繁的一般技术途径和方法:快速生殖过程一般分成以下几个阶段: 预备阶段〔0阶段〕初代培育阶段：无菌培育物的建立； 增殖阶段：芽的增殖,促长；生根阶段：诱导芽生根； 移栽阶段：试管苗的移栽1.1 无菌培育物的建立(初代培育; primary culture) 一般过程包括:(1) 外植体的选择和消毒(2) 培育基和植物生长物质的选择(3) 环境条件的选择和培育初代培育留意事项1） 保证无菌2） 条件适宜3） 技术过关4） 防止褐变褐变缘由：外植体中的酚类化合物在多酚氧化酶的作用下氧化。

影响褐变的因素(1) 植物种类和基因型(2) 外植体的取材部位和生理状态(3) 培育基成分(4) 培育条件和时间防止褐变的常用方法〔目前尚无通用的防止褐变的有效方法.〕1) 选择适当的外植体2) 选择适宜的培育基和培育条件3) 使用抗氧化剂4) 准时转接等1.2 增殖阶段 (芽的增殖; shoot multiplication)使外植体在数量上快速增加罗士韦〔1978〕:植物离体分化过程的类型分5种：1） 无菌短枝型:节培法;微型扦插法2） 丛生芽增殖型3） 器官发生型4） 胚状体发生型5） 原球茎型李文安〔1998〕: 分10类1） 器官型2） 器官发生型3） 胚状体发生型4） 原球茎型5） 球茎芽型6） 块茎型7） 鳞茎型8） 孢子型9） 根茎型10） 微枝扦插型1) 促进侧芽的形成和生长〔丛生芽增殖型；促进腋生分枝〕根本过程：初代培育的芽在适宜的培育基上培育，使侧芽不断分化和生长，渐渐形成芽丛，反复切割和转移到的培育基中继代培育，就可在短时间内得到大量的芽外植体：顶芽或侧芽植物生长物质：细胞分裂素:常用6-BA、KT、2ip和Zt等;一般加0.1~10mg/L，常用0.5~2mg/L ；生长素常用NAA、IBA和IAA，浓度为0.1~1.0mg/L。

培育条件：一般25oC左右;1000~2000 lx照明，每日16h或24h〔或全黑暗〕特点：能较好保持遗传稳定性；但过程较简单2) 诱导不定芽形成不定芽：除现有的芽之外，从任何器官上通过器官发生 重形成的芽.在很多器官和愈伤组织上都能诱导出不定芽但可使嵌合性状遭到破坏〔图5-1〕常用细胞分裂素：6-BA,KT和Zt,浓度0.1~10mg/L; 常用生长素：NAA，IAA和IBA二者比例:一般细胞分裂素高于生长素，但也有承受接近1的配比图5-1 杂色天竺葵的茎尖〔上〕和叶柄〔下〕培育3) 诱导胚状体的形成 (体细胞胚胎发生; Somatic embryogenesis〕外植体选择： 一般使用合子胚、分生组织或子房、花药等生殖器官.植物其它局部也有直接或间接产生胚状体的力量.培育条件：在含有 丰富铵态氮 的培育基上 ,加2,4-D诱导胚状体的发生 ,然后转移到降低2,4-D浓度或没有生长素的培育基上使胚状体成熟和萌发.优点：增殖率高,且具双极性. 应用：人工种子等缺点：很多主要的作物还不能形成胚状体, 或产生的胚状体难以形成植株,或成苗率太低,以及遗传性不够稳定1.3 生根〔根的诱导;根的再生;Rooting〕方法：将增殖的芽剥离下来，分别种植到的培育基上，诱导生根。

植物生长物质：一些植物可以在无激素培育基上生根,其它的需要在培育基中参加适量的生长素,一般浓度为1~10.0mg/L,常用NAA、IBA和IAA根本培育基：一般用盐浓度较低的培育基蔗糖浓度可降低到1.0~1.5%左右1.4 试管苗的移栽〔Transplantation〕炼苗〔驯化〕：试管苗逐步熬炼和适应外界环境条件的过程.试管苗解剖学特点：叶表无角质、蜡质,表皮毛无或极少而薄,气孔不能关闭等. 过程：渐渐降低湿度,渐渐增加光照；加生长延缓剂等2 快速生殖生产中应留意的问题2.1 遗传稳定性影响遗传稳定性的因素主要有：A 外植体来源B 继代培育C 再生植株发生方式D 植物生长物质提高遗传稳定性,削减变异发生的措施主要有:a 选择适宜外植体b 削减继代次数,缩短继代时间;c 使用生长点或侧生分枝方式扩繁;d 选用适当的植物生长物质种类和较低浓度等e 定期检查,剔除形态和生理特别苗;f 尽量促进再生植株开花结实,以检查其生物学性状和经济性状是否稳定.2.2 玻璃化玻璃化现象：指试管苗茎叶呈半透亮或水浸状，外观形态往往特别的现象 是植物组培中特有的一种生理病变影响玻璃苗发生的因素：（1） 培育材料（2） 环境因素（3） 培育基成分可能的预防性措施：（1） 承受固体培育，适当增加琼脂浓度，提高培育基中的蔗糖含量或参加渗透剂， 降低容器内的空气相对湿度。

2） 留意通气，改善容器内的氧气供给避开培育温度过高，一般昼夜变温交替效果较好酌情调整光照时间和强度等3） 降低培育基中的NH4+浓度，依据具体状况调整其他元素的含量适当降低培育基中细胞分裂素的浓度留意碳源种类和浓度的选择PP（4） 其他：如承受热激处理、给培育基添加青霉素G钾、活性炭、聚乙烯醇、CCC 或 等3333 快繁实例1) 唐菖蒲(Gladiolus gandavensis)2) 月季 唐菖蒲快繁7~10d消毒茎尖→→MS0培育基 → → 茎尖膨大① ② ↓↓ ③MS+6-苄基嘌呤(BA)1.0mg/L+萘乙酸(NAA)0.01mg/L或MS+ 6-BA1. 0mg/L+ 感动素1.0mg/L+NAA0.5mg/L的固体培育基④ ↓约25d形成芽丛(每个茎尖可产生10~40 个芽)⑤ ↓芽丛切割,重复③~⑤月季快繁⑥ ↓延长培育,苗的基部渐渐膨大，芽梢伸长转绿⑦ ↓苗长到2.0cm时MS+吲哚丁酸(IBA) 0.5mg/L固体培育基上诱导生根⑧ ↓7~8天见到根的突起,20多天可产生大量的根⑨ ↓进展移栽.强健优良母株的嫩茎去叶↓消毒(70%酒精0.5~2sec, 0. 1%HgCl25~8min),↓ 嫩茎切段(0.5~1.0cm)固体培育基〔MS+ 6-BA0.5~3.0mg/L+NAA0.01~0.2mg/L〕↓日温20~250C,夜温15~200C,每日光照10h,光照强度1000lx.↓20 d左右 ↑形成丛生芽→芽丛切割→→↑↓壮苗培育〔MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.01mg/L固体培育基〕↓枝条长到3cm左右时，切下枝条诱导生根〔MS+1mg/L IBA或0.5~1.0mg/L NAA〕↓7~10d基部愈合并形成根原基↓将苗取出，直接插入稻壳灰与土(1:1)的养分钵中,用塑料薄膜掩盖↓5~6天小苗生根,梢生长 1Mon. 定植或上盆.第2节 无病毒植物的培育附表：危害局部园艺植物的病毒数目1 防治植物病毒病的方法1.1 物理方法1〕热处理脱病毒〔又称温热疗法，thermotherapy〕：温汤浸渍处理(温水浸泡)：适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料；热风处理〔干热处理〕： 休眠组织和正在生长的组织都适用，特别是茎尖培育结合热处理可获得较抱负的脱病毒效果。

热处理的时间和温度因植物种类及器官生理条件不同而异.原则：既能使体内病毒钝化,又能保证肯定程度的寄主存活率.2) 低温处理脱病毒〔冷冻法：cryotherapy〕1.2 化学方法利用能钝化、抑制和消退植物病毒的一些化合物化 合 物植物病毒*寄主三氮唑核苷CMV, PVY, TMV烟草(ribavirin)ACLSV苹果LSV, TBV百合ORSV大花惠兰PVY, PVX, PVS, PVM马铃薯EMCV茄子阿糖腺苷(vidarabine)OMV虎眼万年青碱性孔雀绿(malachite green)PVX马铃薯2-硫尿嘧啶(2-thiouracil)PVY烟草放线菌素-D(actinomycin-D)TMV大白菜*：CMV：黄瓜花叶病毒；PVY：马铃薯病毒Y；TMV：烟草花叶病毒；ACLSV：苹果褪绿叶斑病毒；LSV： 百合潜隐病毒；TBV：郁金香碎色病毒；ORSV：虎眼万年青环斑病毒；PVX：马铃薯病毒X；PVS：马铃薯病毒S；PVM：马铃薯病毒M；EMCV：茄子杂色皱病毒；OMV：虎眼万年青花叶病毒1.3 生物方法1) 种子生殖 适用于不侵染种子的病毒. 但无性生殖作物不适宜.2) 茎尖培育(shoot-tip culture)A. 茎尖培育脱毒的原理越靠近生长点，病毒浓度越低。

可能缘由：传导抑制；酶缺乏；能量竞争；抑制因子B. 茎尖培育脱毒一般过程取材：一般带一两个叶原基的茎尖比较适宜. 剥离和接种培育基：植物生长物质的种类和浓度培育条件影响茎尖培育脱毒成功的因素脱毒培育是否成功取决于两点:离体茎尖能否成活;成活的茎尖还有没有病毒.1) 茎尖大小离体茎尖越大,越易成活,但病毒越难去除. 一般带一两个叶原基的茎尖比较适宜.2) 培育基植物生长物质的种类和浓度茎尖培育的根本过程选择母株──可能时预先进展病毒测定↓ ──必要时进展预先热处理(30~36oC,6~12周)剥离适宜大小的茎尖↓培育─必要时可热处理(30~40oC)↓─必要时在培育基中参加抗病毒化合物再生植株↓切段或其它生殖形成的无性系↙ ↓ ↘局部保存 局部移入室内备病毒鉴定用 局部试管苗直接用于病毒鉴定↓ ↓↓ (1)指示植物 (2)免疫学 (3)电镜(4)分子生物学方法保存 →移栽→无性系选择(有无生理或遗传上的变异)↓ ↘ 品种比照试验(产量,对环境适应性及抗病性等) 选择适宜的无性系进展大量生殖↓无病毒原原种↓扩大繁育生产体系↓ 供给农户3） 微体嫁接〔microgrfting，离体微型嫁接〕是将茎尖培育与嫁接方法相结合，用以获得无病毒苗木的技术。

把茎尖作为接穗嫁接到培育出的无菌实生试管苗砧木上，然后连同砧木一起连续培育，愈合后成为完整植株因接穗易成活，可培育很小的茎尖〔<0.2 mm〕 目前主要应用在果树脱毒方面4） 珠心组织培育柑橘类多胚品种有多个珠心胚珠心与维管束系统无直接联系，由珠心组织培育产生的植株可能免除。