001-经口急性毒性试验方法-改良寇氏法.docx

001-经口急性毒性试验方法-改良寇氏法 急 性 毒 性 试 验 方 法――改良寇氏法K?rber法由K?rber于1931提出，后经Finney改良，顾汉颐作过改良，1963年孙瑞元教授对该法进一步改良，改良后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和101%死亡率的校正式，所得LD50及全部有关参数与正规概率单位法相近改良寇氏法〔K?ber〕试验设计的原那么是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在10%～50%之间，另一半在50%～101%之间，最好出现0 %和101 %的剂量组 一、剂量选择及分组1、剂量选择剂量设计是否合理是急性毒性试验能否胜利的关键探求外源化学物的急性毒性，测定其LD50或LC50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学构造和理化性质，如构造式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD50的计算方法，然后设计剂量 2、预试验： 总的原那么是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量〔b〕和全部不致死的最大剂量〔a〕，即求出待测化学物0 %~101 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个剂量组，组间剂量呈等比级数〔r〕，其比值为1.2~1.5。

进展正式试验用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180~200g，小鼠18~22g，豚鼠200~250ｇ，家兔2~2.5kg，犬10~12 kg用于试验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%仍旧遵守雌雄各半或雌雄兼取的原那么当预试中发觉化学物的毒性有明显的性别差异时，那么须要选用雌、雄两种性别的动物分别进展试验，求出各自的LD50 通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组 按下式设计剂量组：r?n?1b a式中：r—相邻两组剂量的比值，一般为1.2～1.5，b—最低全致死剂量量， a—最高不致死剂量， n—设计的组数 分组恰当与否也是确保试验结果精确的条件之一因为组数过多，须要消耗较多的动物，还可能出现较大剂量组动物死亡率低于较小剂量组；组数过少，不能较准确求出LD50 3、依据公比(r)计算各组剂量各组剂量分别为： 第一组：a 其次组：a r 第三组：a r2 1第四组：a r3 第五组：a r4 第六组：a r5二、受试物溶液配制1、溶剂的选择毒理学试验中，常用的剂型有液体剂型、固体剂型。

液体剂型中有溶液剂、混悬剂、乳化剂等选择溶剂的原那么是不与受试物发生化学反响，不变更化学物的毒性，故应依据受试物的理化性质，选择适当的溶剂一般而言，水溶性化学物可选择蒸馏水或生理盐水，以水为溶剂，既经济、便利、易汲取，又无毒副作用脂溶性化学物多项选择用植物油，如花生油、橄榄油不溶于水而溶于油的化学物常用吐温-80或吐温-60配制成乳化剂既不溶于水又不溶于油脂的化学物可选择淀粉液、明胶液、羧甲基纤维素钠液〔0.5-1% CMC〕等助悬剂配制成混悬液如用有机溶剂，试验动物应设溶剂参照组，有机溶剂所用比例不宜超过10%，溶解后，再用水稀释，必要时可参加增溶剂，如吐温-80、聚乙二醇等，以提高溶液剂的浓度 2、配制方法受试化学物的配制方法有等浓度稀释法和等容量稀释法等浓度稀释法 将受试物配制成一种浓度，不同剂量组试验动物单位体重所给受试物的体积不同，剂量越高，所用的体积越大；剂量越低，所用的体积越小比方某受试物的试验剂量分别为101、200、400和800mg/kg，受试物配制成10 mg/ml，每组动物每10g体重分别给与0.1、0.2、0.4和0.8 ml等容量稀释法 将受试物配制成不同浓度，不同剂量组试验动物单位体重所给受试物的体积一样，剂量越大，受试化学物配制的浓度越高。

上例中，假设试验动物按0.2ml/10g b.w容量灌胃,那么应配制成4个不同浓度,即5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml和40mg/ml灌胃体积依所选用的试验动物而定，一次灌胃的体积为：小鼠0.1～0.4ml/10g b.w，每只不超过1ml；大鼠0.5～1ml/101g，每只不超过4ml;家兔在5ml/kg之内;犬不超过50ml/kg；为幸免操作误差，等容量稀释的传统方法常采纳1∶K系列稀释法该法操作简便、浓度准确、节约受试化学物 a、 确定各剂量组所需受试液浓度如确定最高剂量组剂量为2000mg/kg b.w.，小鼠按等容量方法赐予受试药液，即0.2ml/10g b.w.，相当于20ml/1010g b.w.，故最高剂量组所需受试液的浓度〔母液浓度〕为2000 mg/20ml，即10.0%〔C1〕 b、 确定每组所需受试液的量〔m ml〕按每只鼠体重25g计算〔将损耗也计算在内〕，给药量为0.2ml/10g b.w.，那么每组10只动物所需受试液的量为5ml； c、 确定母液总量配制时，依据试验设计要求确定最高剂量组所需受试化学物的浓度和总体积，配制母液设母液浓度为C1，各组所须要的量为m ml，母液应配制的总量M用下述公式计算：M?m 1?K式中， K为各组剂量的比值，K=1/r。

2d、 配制母液选择适当的溶剂配制浓度为C1的受试液，取M ml作为母液，从母液中取出m ml供最高剂量组染毒用；然后取m ml溶剂参加剩余的母液中，混匀，稀释后的母液浓度为C2〔C1 ：C2=1：k= r〕，即次高剂量组所要求的浓度，从中取出m ml供次高剂量组染毒用〔第2组〕，然后再参加m ml溶剂，其稀释后的浓度为C3〔C2 ：C3=1.2〕，取出m ml供第3组动物染毒用依此类推，可配制成按1∶K递减的各剂量组不同浓度的试液 三、染毒各组小鼠分别按等容量方法赐予相应浓度的受试药液，即0.2ml/10g b.w.四、视察指标与试验期限急性中毒病症及出现时间，死亡数量、时间大体剖检改变 试验期限为7-14天五、结果及LD50的计算采纳寇氏法计算LD50及其95%可信限 1、试验结果列表表 试验结果组别 1 2 3 4 52 计算LD50当急性毒性试验的最大剂量死亡率为101%，最小剂量的死亡率为0%；各组动物数相等；各剂量组的组距等比或剂量对数等差时，用下述根本公式计算LD50：LD50?log?1[Xm?i(剂量〔mg/kg〕 试验动物数 10 10 10 10 10 死亡动物数 死亡率〔p〕 存活率〔q〕 ?p?0.5)]3?Pm?Pn)] 4当不含0%和101%死亡率时，用下式计算LD50：LD50?log?1[Xm?i(Sx50?p?pq? ?in以上各式中：i—组距，即相邻两组剂量对数剂量之差Xm—最大剂量对数P—各剂量组死亡率(死亡率均用小数表示) Pm—最高死亡率q—各组剂量存活率，q=1-p 3Pn—最低死亡率∑p—各剂量组死亡率之和 n—各组动物数 Sx50—logLD50的标准误LD50 的95 %可信限=log-1(log LD50±1.96×Sx50)改良K?rber法的优点是计算简便、结果准确，管用性大。

我国《新兽药一般毒性试验技术要求》规定用此法计算新兽药的LD50举例：给小鼠口服某药进展急性毒性试验，测定LD50选择体重18~24g安康小鼠〔雌雄各半〕，按随机方法将动物分为5个组，每组10只经预试找出死亡率在0~101%的剂量范围大约为300~600mg/kg b.w. 〔1) 预试 〔略〕 〔2〕 计算公比r?n?1b ar= 5-1 600/300 =4 2 =1.189 ≈1.2 ?? 〔3〕 依据公比(r)计算各组剂量因而各组剂量分别为：第一组：a=300mg/kg b.w.其次组：a r =300?1.2 = 360mg/kg b.w. 第三组：a r2 =300?1.2 2 = 432mg/kg b.w. 第四组：a r3 =300?1.2 3 = 518mg/kg b.w. 第五组：a r4 =300?1.2 4 = 622mg/kg b.w.〔4〕 受试液配制采纳1：K系列稀释法配制不同浓度的受试液〔K＝1/r〕a、 确定各剂量组所需受试液浓度：确定最高剂量组剂量为622mg/kg b.w.，小鼠按等容量方法赐予受试药液，即0.2ml/10g b.w.，相当于20ml/1010g b.w.，故最高剂量组所需受试液的浓度〔母液浓度〕为622 mg/20ml，即3.11%〔C1〕； b、 确定每组所需受试液的量按每只鼠体重25g计算〔将损耗也计算在内〕，给药量为0.2ml/10g b.w.，那么每组10只动物所需受试液的量为5ml；c、 确定母液总量各组动物需用本组浓度受试液的用量为5 ml〔m〕；各剂量组之比为0.833〔k=1/ r〕，那么母液应配制的总量为〔ml〕： 4 5 1?0.833 d、 配制母液选择适当的溶剂配制浓度为3.11%〔C1〕的受试液，取30 ml作为母液，从母液中取出5ml供第五组〔最高剂量组〕接毒用，然后取5 ml溶剂参加25ml母液中混匀，稀释后的母液浓度为2.59%〔C2〕〔C1 ：C2=1：k=1.2〕，即第四组〔次高剂量组〕所要求的浓度，从中取出5 ml供第四组接毒用，然后再参加5 ml 〔? ml〕溶剂，其稀释后的浓度为2.16%〔C3〕〔C2 ：C3=1.2〕，即第三组所需的浓度。

依此类推，可配制其次组、第一组所需浓度的受试液，分别为1.80%、1.50% 〔5〕 接毒各组小鼠分别按等容量方法赐予相应浓度的受试药液，即0.2ml/10g b.w. 〔6〕 视察指标〔7〕 结果及LD50的计算采纳寇氏法计算LD50及其95%可信限 a、将试验结果列入下表，按改良寇氏法进展计算；表 试验结果组别 1 2 3 4 5b、按以下公式计算：LD50?log?1[Xm?i(=29.101101≈30〔ml〕 剂量〔mg/kg〕 300 360 432 518 622 试验动物数 10 10 10 10 10 死亡动物数 0 2 5 7 10 死亡率〔p〕 0 0.2 0.5 0.7 1.0 存活率〔q〕 1.0 0.8 0.5 0.3 0 ?p?0.5)]即：logLD50=Xm?d〔?p?0.5〕Xm=log622=2.7938 i=log 1.2=0.0792 p=0+0.2+0.5+0.7+1.0=2.4代入公式：logLD50= 2.7938?0.0792〔2.4?0.5〕=2.6433 c 查反对数求出LD50=439.87 mg/kg b.w. 5d 计算LD50的标准误〔S〕：Sx50?i?pqn=0.0792×0.249=0.0197e 计算LD50的95%可信限：LD50的95%可信限= log?1〔logLD50±1.96×SlogLD50〕= log?1〔2.6433±1.96×0.0197〕 = log?1〔2.6433±0.0386〕= log?1〔2.6047?2.6819〕=402.44~480.73 mg/kg b.w. 6 。