氟苯尼考的高效液相色谱检测方法.doc

武汉轻工大学毕业论文 论 文 题 目：鸡血浆中氟苯尼考的高效液相色谱检测方法 Development of a HPLC for determination of florfenicol in chicken plasma 姓 名： 吕阳 学 号： 院 （系） 动物科学与营养工程学院 专 业 动物生物技术 指导教师 刘宇 2023年6月1日目 录摘 要 1Abstract 2第一章 绪 论 31氟苯尼考的研究进展 31.1氟苯尼考的药品信息 31.2氟苯尼考的临床应用 41.3氟苯尼考的检测方法 52研究目的与意义 63研究内容 6第二章 实验研究 71 材料与方法 71.1实验材料 71.2实验动物 71.3实验方法 72 结果与计算 82.1波长选取 82.1工作曲线 102.2回收率与精密度 102.4 HPLC检测图谱 113讨论 13第三章 结论与建议 141 结论 142创新点 143有待进一步研究的问题 14参考文献 15致 谢 16摘 要 本文建立了鸡血浆中氟苯尼考含量的高效液相色谱检测方法，方法的线性范围为1.0～200 µg/ml，线性方程为y = 520230x + 170000（r =0.9994），回收率达成86.3%～98.5%，方法的定量限最低为0.1 µg/ml，日内与日间相对标准偏差均小于5%。

本法的色谱柱使用Waters 04590型Symmetry-C18柱（4.6×150 mm,5μm），柱温为30℃，流动相使用乙腈：水=27:73（V:V），进样量10 µL，流速1.0 ml/min，紫外检测波长为230nm经验证，本方法具有简便快捷、定量准确，线性关系良好，回收率较高等优点，可认为氟苯尼考的药物代谢动力学研究提供定量依据和检测基础关键词： 氟苯尼考，高效液相色谱，鸡AbstractThis paper established the chicken florfenicol in plasma of high performance liquid chromatography (HPLC) method, the linear relationship between the absorbance and concentration of tilmicosin was in the range of 1.0 to 200μg/ml with a minimum detection limit of 0.1μg/ml (r = 0.9997), the linear equation: y = 12674x + 16319, the recoveries ranged from 86.3% to 98.5%, the values of intra-day relative standard divination and inter-day relative standard divination were less than 5%.Waters 04590 Type Symmetry-C18 column (4.6 × 150 mm, 5μm) was used in the analysis,a mixture of acetonitrile-water,at a flow rate of 1.0 ml/min was used as mobile phase, passing through the column at 30 ℃. Ultraviolet detection was performed at the wavelength of 230nm. Key words: High Performance Liquid Chromatography,Florfenicol, Chicken 绪 论1 氟苯尼考的研究进展1.1 氟苯尼考的药品信息 氟苯尼考（florfenicol）[1]又称作为氟甲砜霉素，由于其拥有广泛的抗菌谱，在体内极易吸取，分布较为广泛，治疗剂量下未发现毒副作用，防治效果显著，对于敏感菌所引发的动物细菌性疾病具有极佳的治疗效果，广泛应用于养殖业中，是兽用药物中目前正在广泛推广使用的一种新型的氯霉素类的广谱抗菌药。

现如今，氟苯尼考已经在水生动物、禽类、猪、反刍动物以及其他畜禽的细菌性疾病[2]的防止和治疗中广泛使用，目前我国已经通过了该药的审批1.1.1 性状与结构 纯净的氟苯尼考的性状为结晶性粉末，白色或类白色，无臭在通常情况下，在有机溶剂中溶解度较高，溶解在水中的剂型大多为混悬液氟苯尼考在二甲基甲酰胺中溶解度极高，溶解于甲醇，溶剂为冰醋酸时略微溶解，水或氯仿时中的溶解度极低[3]浓度为0.5%的氟苯尼考水溶液的酸碱度大约在4.5～6.5范围内[4]市场上出售的氟苯尼考商品名称（国际通用）多数称之为Florocol和Nuflo[5]氟苯尼考的化学式为C12H14Cl2FNO4S ，其相对分子质量为358.22，化学结构式[6]如图1：图1 氟苯尼考结构式1.1.2 药效学 氟苯尼考是属于氯霉素类的广谱抗菌药，与氯霉素（CHL）和甲砜霉素（THI）具有相同的作用机理和抗菌谱，它可以与细菌有效地特异性结合，可以通过减少相关酶的活性从而使肽链延伸受到克制作用，进而干扰甚至丧失了细菌合成蛋白质的功能[7]然而，结构的修饰与改造令氟苯尼考与CHL和THI相比，显著增强了安全性和有效性在结构上，氟苯尼考用氟原子取代了CHL和THI中丙烷链上第3个碳原子位置上的羟基，从而对菌体蛋白的乙酰化反映产生阻碍和克制作用，进而使氟苯尼考不受相关酶的影响，避免了药物的灭活。

因而，氟苯尼考不容易出现由质粒介导的耐药性，并且对于大量具有耐CHL基因的病原体，氟苯尼考依旧敏感氟苯尼考对于大多数细菌都具有杀灭或克制作用，同时对于厌氧的革兰氏阳性菌和阴性螺旋体，以及立克次氏体，阿米巴原虫等都具有较为显著的抗菌作用[5]1.1.3 药动学氟苯尼考在机体内见效快，连续时间长根据研究者的实验得出，肌肉注射氟苯尼考1小时以后，血液中的药物浓度可以达成治疗浓度，1~3 小时后便可以达成高峰期的血药浓度只需一次给药，有效的血药浓度便可以维持48~72小时以上，并且不会出现骨髓克制和再生障碍性贫血的危害氟苯尼考在体内分布广泛，可以透过血脑屏障来克制和治愈动物细菌性脑膜炎，相比于其他的抗菌药，氟苯尼考可具有极强的治疗效果在机体内，部分器官的氟苯尼考药物浓度较高，血药浓度可以达成治疗效果，重要通过肝脏、肾脏代谢，少量的药物可以随粪便由体内排出根据动物的种类和给药方式的不同，氟苯尼考的药物代谢动力学会有略微差异1.1.4 耐药性 由于临床上氟苯尼考的使用方法不妥，如今已经开始出现氟苯尼考的耐药菌株，应当即刻引起人们的广泛关注1996 年，Kim 等研究人员第一次发现并且命名了一种可以耐氟苯尼考的基因pp-Flo，根据DNA的序列分析显示得出，pp-Flo基因有47.4%的几率与非酶介导的导氟苯尼考耐药基由于同源基因。

在此之后，研究者又陆续地克隆出了多种不同的氟苯尼考的耐药基因，重要是从沙门氏菌、大肠杆菌以及葡萄球菌属中得到，涉及Flo、Flor、FexA 和Cfr等基因总体来讲，根据目前的研究结果，重要有Flo、Flor、FexA、以及Cfr 和pp-Flo[9]这五种可以耐氟苯尼考的基因1.2 氟苯尼考的临床应用氟苯尼考如今已经广泛投入使用在各种水生动物（涉及鱼、虾、蟹、鲍、贝等在内）的养殖业中氟苯尼考可以显著地防止和治疗各种急性、慢性的细菌性疾病，例如黄尾鱼的假核性巴氏杆菌病及链球菌病、大西洋鲑鱼疖病[9]、黄尾鱼巴氏杆菌感染、鳗迟钝性爱德华氏菌感染、以及鲑杀鲑弧菌性感染[10]等 在猪的养殖业中，在防止和治疗猪喘气病、胸膜肺炎与沙门氏菌病，涉及大肠杆菌性下痢、萎缩性鼻炎以及猪丹毒、猪肺疫和无乳综合症等在内的疾病中，氟苯尼考具有显著的防治效果对于猪胸膜肺炎放线杆菌，氟苯尼考的最小抑菌浓度（MIC）的范围在0.20~1.56 µg/mL之间，它对于猪胸膜肺炎放线杆菌的最佳抑菌浓度是0.39 µg/mL相比较于阿莫西林（AMX）以及恩诺沙星这两种药物，氟苯尼考对猪链球菌病的治愈率[11]明显的高于两者。

氟苯尼考同样广泛地用于防止和治疗牛的细菌性疾病[2] ,且防治效果是其他同类药物所不能及氟苯尼考可以用于防治牛呼吸系统疾病[12] 、牛肠炎[13] 、牛无名热[14]单独使用氟苯尼考时，可以明显地克制溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和嗜血杆菌三种引发牛呼吸道疾病的重要病原体，可以显著地治疗牛的呼吸道感染疾病[15]值得一提的是，各成长阶段的肉牛都可以使用氟苯尼考的注射剂目前，氟苯尼考在禽类养殖业的细菌性疾病防治中占有着举足轻重的地位根据研究者的实验证明，按照1∶5的比例，药物浓度50 µg/mL来配伍甲氧苄啶（ TMP ）和氟苯尼考两种药物，即每毫升的药液中具有氟苯尼考42 微克，甲氧苄啶8 微克，可以极佳的治愈鸡的大肠杆菌病[16]每12 小时以20~40 µg/kg的剂量肌肉注射给药或者口服给药氟苯尼考一次，连续使用三天，可以很好的治疗鸡的多杀性巴氏杆菌病，且效果较为明显[17]使用氟苯尼考可显著地防止和治疗鸭的传染性浆膜炎，实验表白，将氟苯尼考用于同一种群中出现临床症状的病鸭，传染性浆膜炎的治愈率平均可以达成96.8%；将氟苯尼考用于同一种群中尚未出现临床症状的鸭种（假定健康鸭），其传染性浆膜炎的平均防止有效率达成了97.1%[18]。

假如使用氟苯尼考与多西环素（DOX）的复方制剂，效果相称于甚至高于单独配方的氟苯尼考可溶性粉[19]该复方制剂可以有非常效地克制鸡的大肠杆菌感染且缓解病鸡的临床症状，并可以显著减少鸡由大肠杆菌感染引起的发病和死亡的几率，且在一定限度上，该制剂可以减少成活鸡的体重下降1.3 氟苯尼考的检测方法目前，用于检测动物性食品中氟苯尼考含量的方法重要使用气象或液相色谱与色谱质谱联用法，其中高效液相色谱法与液相色谱-质谱联用法最为广泛当然，根据条件、目的、用途的不同，目前也常用其他的氟苯尼考检测方法，其中重要有电位法、分光光度法、酶联免疫吸附法（ELISA）、胶束电动毛细管色谱法等1.3.1 气象色谱（GC）与液相色谱法（LC）使用GC与LC法进行氟苯尼考的含量测定期，提取样品中氟苯尼考的药物残留的重要提取液通常使用乙酸乙酯与甲醇、以及乙腈和丙酮等有机溶剂，其中，乙酸乙酯的提取效率最高[19]常用的固相萃取柱有C18柱[20]、HLB柱[19]、MCX柱[21]或Florisil柱[22]等在使气象色谱法分析之前，需要进行样品前解决反映-硅烷化和酰化，以此来生成热稳定性强并且容易挥发的衍生物，通常需要使用氢火焰离子检测器（FID）或者电子捕获检测器（ECD）[23]来检测衍生化反映完毕之后的样品，。

使用液相色谱法检测时，色谱柱通常使用的是C18柱。