植物组织培养：第十章植物原生质体培养.ppt

第十章植物原生质体培养原生质体（Protoplast） 1880,Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞 原生质体培养再生植株技术是细胞融合（cellfusion）和体细胞杂交（somaticcellhybridization）基础微丝叶绿体线粒体质膜液泡细胞核内质网微管细胞壁高尔基体植物细胞模式图植物细胞模式图细胞壁由三种主要成分构成纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%一、原生质体培养发展简史及其意义1、发展简史1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体； 1960年：1960年英国诺丁汉大学Cocking教授率先利用真菌纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体； 1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场； 1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟草叶肉原生质体，两步法和一步法 1971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首次获得再生植株1993年有49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株其趋势主要是农作物和经济植物，从一年生扩展到多年生，从草本到木本、从高等植物到低等植物，食用菌、藻类、大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、柑桔、猕猴桃、桃、苹果、马铃薯、胡萝卜、黄瓜、杨树、云杉等； 1986年：Spangenberg单个原生质体培养成功；2、原生质体培养的意义（1）为细胞融合奠定基础。

有性杂交不能进行细胞质交流（2）是遗传工程的理想受体能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物Isolatedprotoplastarecapableofingestingforeignmaterialintothecytoplasm.Thismaterialincludestheintroductionofnuclei,chloroplasts,mitochondria,DNA,plasmids,bacteriaandviruses.原生质体也具有全能性原生质体是分子水平和细胞水平上研究遗传信息动态的结合点（3）理论研究细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染因为细胞壁不仅具有保护功能，还参与细胞的生长和分化等生命活动但是必须指出：原生质体必须再生出细胞壁才能继续发育 （一）设备与工具 除了需要组织培养的设备和工具之外，还需要一些用具 1、倒置显微镜荧光显微镜反照相设备 普通显微镜：原生质体或细胞培养密度（采用血球计数板） 倒置显微镜：观察培养皿、培养瓶或滴瓶中的培养物 荧光显微镜：检查原生质体活性及去壁情况二、原生质体的分离 2、细菌过滤器 0.45m的滤膜可以滤去细菌和病毒 （1）可用抽滤瓶接真空泵抽滤灭菌 （2）可用注射器推压过滤灭菌 3、离心机 提纯原生质体500r/min离心3-5min 制备酶液用2500r/min离心10min（二）分离方法机械法：利刃机械切割酶解法：果胶酶和纤维素酶处理1、Machanicalisolation Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell. In practice this technique is difficult and the yield of viable protoplasts is meager. One advantage, however, is that the deleterious effects of the wall-degrading enzymes on the metabolism of the protoplasts are eliminated.从高度液泡化的细胞 机械法：细胞置于一种质壁分离介质中，然后利用利刃切割，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体。

缺点：a.产量低 b.由分生细胞和其他液胞化程度不高的细胞分离原生质体时不适用2、Enzymaticisolation双子叶外植体/培养细胞 单子叶植物胚性细胞2-1 材料获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞 植物组织外植体 培养材料：培养细胞、悬浮培养细胞、愈伤组织等材料选择的注意事项 1）选择具有形态分化潜力的材料，使原生质体经培养后容易诱导器官的发生 2）选择经酶处理后可以得到大量原生质体的材料，使原生质体的产量维持较高水平 3）经酶处理后原生质体稳定性好，不易破碎 4）所得到的原生质体活性高，可持续分裂材料来源影响原生质体产量和活力 最简单、最普遍的来源叶片，可以分离出大量的比较均匀一致的细胞，而又不致使植物遭到致命破坏叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易到达细胞壁 由叶片制备原生质体， 植株的年龄和生长条件非常重要： A.温室或生长室栽培的叶片：低光照强度，短日照，2025，相对湿度6080%，充足的氮肥。

B.离体培养的叶片：植物原生质体产量取决于细胞的生长速率和生长时期频繁继代的悬浮培养物以及处于对数生长早期的细胞，是最适宜的供体材料2-2酶的种类和浓度纤维素酶（Cellulase）OnozukaR-10果胶酶（Pectolyase）Y-23半纤维素酶（Hemicellulase）对幼叶来说，酶浓度较低：0.5-1纤维素酶，果胶酶(0.2-0.5);酶量少对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1或2酶量大酶液PH值：5.4-5.8因为PH高，酶活性低PH低，原生质体损坏多 原生质体分离的情况在很大程度上取决于所用酶的性质和浓度 纤维素酶消化细胞壁纤维素 果胶酶主要是降解中胶层 半纤维素酶 酶的活性与pH有关 酶活性的最适温度为4050 酶的浓度和酶处理持续时间须经若干次实验后才能决定 酶溶液中保温时间从30min20h 酶溶液的容积和植物组织数量之间关系也可影响原生质体产量 一般来说，每1g组织用10ml酶溶液常可产生令人满意的效果2-3酶液渗透压裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构因此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁对原生质体起保护作用。

常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持渗透浓度浓度一般为0.4-0.8mol/L而蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用 在合适渗透压溶液中，新分离出来的原生质体看上去都是球形的 原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更稳定 较高水平的渗透压可以阻止原生质体破裂和出芽，同时也会抑制原生质体的分裂 用非电解质作为渗透压稳定剂，常要在酶溶液中补加某些盐类，尤其是CaCl2，以便提高质膜的稳定性2-4 材料预处理 (暗处理，预培养和低温处理)在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，使细胞预质壁分离约一小时后再用酶液处理 原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率 要保证酶解充分进行，必须促使酶液渗入到叶片细胞间隙去，采用方法有： A.撕去叶片下表皮，然后以无表皮一面向下，使叶片漂浮在酶溶液中 B.撕不掉或难撕的叶片，可把叶片或组织切成小块，投入到酶溶液中，与真空渗入结合，效果更好。

C.用金刚砂摩擦叶的下表面2-6 其它酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力2-5酶解处理的条件光：一般黑暗下静止进行；温度：25，兼顾原生质体及酶活性；时间：几小时到几十小时，太长不利于原生质体的活性，一般24小时如烟草叶片酶处理2小时后叶肉细胞解离完毕2-7原生质体分离过程：一步法（以烟草叶片为例） 第一步：预处理即对烟草植株限制供水 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外表皮切成4cm的小块 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶0.5%）并加入的0.7mol甘露醇0.1mmolCaCl2.PH5.6 第四步：将小块烟叶放入混合酶液25处理810小时 第五步：过滤、离心、洗涤（0.7mol甘露醇液含0.1mmolCaCl2）如此23次、得原生质体图示原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心加果胶酶和纤维素酶（三）原生质体纯化 酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养 原生质体纯化方法有：离心沉淀法，漂浮法，接口法三种1、离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。

步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤 第二步离心（5001000r/min离心56min） 第三步吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新悬浮，再离心沉淀如此23次 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体洗涤液成分：0.45mol/L甘露醇，10mmol/LCaCl2H2O, 0.7mmolK H2PO4,洗涤液pH： 5.6例如 1）将镍丝网滤出液置于离心管中，在75100g下离心23min后弃去上清夜再把沉淀物重新悬浮于清洗培养基中，在50g下离心35min后再悬浮，如此反复3次 常用原生质体清洗培养基为CPW盐溶液，成分为（mg/L）KH2PO4(27.2)，KNO3(101.0)，CaCl22H2O(1480.0)，MgSO47H2O(246.0)，KI(0.16)，CuSO45H2O(0.025)，pH5.8 2）将悬浮在少量酶混合液或清洗培养基中的原生质体沉淀和碎屑置于离心管内蔗糖溶液的顶部，在100g下离心10min碎屑下沉到管底后，一个纯净的原生质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上 用移液管小心地将原生质体吸出，转入另一离心管中，反复离心和重复悬浮，再将原生质体清洗3次，最后以适当的密度悬浮在培养基中。

2、接口法以柑桔为例25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间 只通过一次离心即可得到不混有酶和碎屑的完整无损的原生质体 在离心管中依次加入溶于培养基中的500mmol/L的蔗糖，再加入一层溶于培养基中的140mmol/L蔗糖和360mmol/L山梨醇，最后是一层悬浮在酶溶液中的原生质体，其中含有300mmol/L山梨醇和100mmol/LCaCl2，经400g5min离心后，刚好在蔗糖层之上会出现一个纯净的原生质体层，而碎屑则移到管底3、漂浮法原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面洗涤液：3%蔗糖+0.4mol/L甘露醇+1480mg/LCaCl22H2O，或11%23%的蔗糖溶液原生质体分离纯化流程图（四）原生质体活力测定孢质环流法作为进行活跃代谢的指标以氧的摄入量为指标以光合活性做指标以完整的质膜排斥伊凡蓝的能力做指标 FDA测原生质体活力的原理FDA染色测定原生质体 取纯化后的原生质体悬浮液0.5ml，置于小试管中，加入贮存于0，含2mg/L的FDA的丙酮溶液，最终浓度为0.01%，室温下5min后观察，绿色荧光的为有活力的，无荧光的为无活力的。

三、原生质体培养固体包埋培养液体浅层培养固液培养饲养层培养法共培养法1、固体包埋培养原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖（37C左右）混合，培养于培养皿中 优点：原生质体位置固定不变，可跟。