多花指甲兰花粉活力及柱头可授性研究.docx

多花指甲兰花粉活力及柱头可授性研究 王清芸 侯天泽 徐诗涛 余文刚 邢孔惠 王健摘 要：花粉和柱头特性的研究是兰花杂交育种的重要基础本研究以多花指甲兰（Aerides rosea）为实验材料，利用扫描电子显微镜观察多花指甲不同开花时期的花粉微观形态用TTC（氯化三苯基四氮唑）、I2-KI和醋酸洋红染液并结合花粉离体培养检测不同开花时期的花粉活力，利用联苯胺-过氧化氢法测定柱头的可授性结果表明， 多花指甲兰花粉随着开花时间的延长，花粉表面颜色变深，质地更硬，花粉粒结合更加紧密，花粉团体积变小，表面变得更加平滑致密 多花指甲兰花蕾期花粉染色为粉红色，盛花期的花粉染色最明显，染色率最高，而衰败期的花粉几乎无法被染色，在整个开花过程中，花粉活力呈先上升后下降的趋势柱头可授性的结果显示，盛花期柱头气泡最多最迅速，可授性最强该研究结果为多花指甲兰的引种栽培、迁地保护提供理论基础，在花卉资源利用和产业发展上具有重要指导意义关键词：多花指甲兰（Aerides rosea ）;花粉形态;花粉活力;柱头可授性Abstract： The study on the characteri stics of pollen and stigma is an important basis for orchid cross breeding. In this study， Aerides rosea was used as the experimental materi al to observe the micro-morphol ogy of pollen at different flowering stages by scanning electron microscope. The pollen viabil ity at different flowering stages was detected by TTC （triphenyltetrazolium chloride）， I2-KI and magenta acetate staining solution combined with pollen culture in vitro， and benzidine-hydrogen peroxide method was used to determine the receptivity of stigma. The resul ts showed that with the extension of flowering time， the surface col or of A. rosea pollen became darker， the texture became harder， the pollen grains combined more closely， the pollen mass became smaller， and the surface became smoother and denser. A.s rosea pollen staining was pink in the bud stage， the pollen staining in the full flowering stage was the most obvious， and the staining rate was the highest， while the pollen in the decline stage could hardly be stained. In the whole flowering process， the pollen viabili ty increased at first and then decreased. The resul ts of stigma receptivity showed that the stigma bubbles were the most rapid and the receptivity was the strongest at flowering stage. The results of this study would provide a theoretical basis for the introduction， cultivation and ex-situ protecti on of A. rosea， and have important guiding signi ficance in the util ization of flower resources and industrial development.Keywords： Aerides rosea; pollen morphology; pollen vitality; stigma receptivity多花指甲兰（Aerides rosea）为兰科（Orchidaceae）指甲兰属附生草本植物，花型奇特，状似“狐尾”，花序密集，花大部白色，稍有紫色点缀其间，观赏价值高[1]。

更重要的是，多花指甲兰极具芳香，独特的芳香性状也是多花指甲蘭的重要价值之一其含有醛类、芳香族类、酯类、酮类以及萜类化合物等多种挥发性物质，可广泛应用于化妆品、美容等行业[2]，近年，一家日本公司公布了其香水专利，构成其产品成分的一种主要香味物质便来自于此[3]同时，多花指甲兰也是重要的药用兰花，在印度东北部当地部落居民有使用指甲兰属植物治疗常见疾病的习俗，孟加拉国和泰国也有相关报道[4]，国内研究人员也发现指甲兰属植物有作为抗癌药物潜能[5]多花指甲兰不仅拥有花型、花色和香味等众多优良性状，是不可多得的优秀亲本资源[6]，而且在医药业、化工业也广泛运用，具有重大开发潜能多花指甲兰常附生于乔木上，由于过度的资源开采、旅游开发等生态破坏行为，以及对其附生树种的乱砍滥伐、野生植物非法贸易，导致多花指甲兰野生种群的生存面临极大威胁CITES（《濒危野生动植物种国际贸易公约》）将指甲兰属的所有种列入其附录Ⅱ的保护对象我国也将其列入国家重点野生植物保护名录（第二批次）我们应积极对其采取相关保护措施[6]但由于种质资源匮乏等原因，国内目前较少见到多花指甲兰的相关报道，花粉形态观察和花粉活力测定以及柱头可授性更是鲜有报道，还有极大的挖掘空间。

花粉和柱头具有较高的活性是杂交育种成功的关键，目前，国内外主要使用花粉染色法和花粉离体培养测定花粉活力常见染色方法有醋酸洋红染色法、I2-IK染色法和TTC染色法据文献报道，最符合真实值的方法为TTC染色法[7-9];而花粉离体培养是最能反映真实值的方法[10]柱头可授性均利用联苯胺-过氧化氢法测定[11]当前，仅有少数研究人员以市场上常见的几种兰花为材料进行了花粉形态、花粉活性以及柱头可授性的研究褚怡等[11]研究了大花蕙兰和几种国兰的花粉活力和柱头可授性，喻兰等[12]对蝴蝶兰的花粉活力和柱头可授性进行了测定罗远华等[13]以20个文心兰种质为材料，对花粉活力进行测定这些研究明确了各材料最佳的授粉时机，为兰花的杂交育种、引种栽培提供了理论指导本文在前人的基础上对多花指甲兰的花粉形态、花粉活力以及柱头可授性开展研究，以期为多花指甲兰的杂交引入、迁地保护以及后续的应用开发提供理论指导1 材料与方法1.1 材料材料来源于云南省澜沧县（9929′E～ 10035′E、2201′N～2316′N之间），为野生种，目前种植于海南大学育苗基地（2003′N，11019′E）使用试剂为氯化三苯基四氮唑（TTC）、I2-KI以及醋酸洋红染液。

试验器材为镊子、解剖针、解剖刀、盖玻片、载玻片、10mL离心管、恒温培养箱、光学显微镜（BA210-T）等1.2 方法1.2.1 多花指甲兰花粉电镜扫描 采集花蕾期、盛花期、衰败期的多花指甲兰花粉（图1），经离子溅射仪喷金后，置于场发射扫描电子显微镜下观察（S-4800）选取各时期花粉在30、100、500的视野下观察并对各开花时期花粉块的形态结构进行拍照记录1.2.2 花粉活力染色测定 结合胡适宜[14]与罗远华等[13]的方法，并在此基础上进行优化，具体为用pH为7.2～7.4的10 0. 01mol/L磷酸缓冲液配成0.5%的TTC溶液、I2-KI以及醋酸洋红染液取不同开花时期新鲜花粉团，将花粉捣碎于载玻片上，用镊子与解剖针使之充分分散，然后滴加适量新鲜配制的TTC染色液、I2-KI以及醋酸洋红染液，盖上盖玻片，用锡箔纸包裹黑暗处理置于35℃恒温箱中24h后在光学显微镜下观察统计花粉活力，每张片子随机计数5个视野的染色率，染成红色的为活力强的花粉，淡红色为活力弱的花粉，无活力或不育的花粉无法被染色1.2.3 花粉离体萌发 以钱鑫等[15]、郭丽霞等[16]的研究为基础对培养基进行优化，预实验结果表明，最适培养基为：20%蔗糖+20mg/L硼酸+ 10mg/LCaCl2，在25℃恒温中暗培养48h之后于光学显微镜下观察花粉萌发情况，以花粉管长度超过花粉粒直径的2倍为萌发标准，并选择3个视 野进行计数。

1.2.4 柱头可授性检测 用联苯胺-过氧化氢法测定多花指甲兰柱头活性联苯胺-过氧化氢反应液用1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水=4∶11∶22配制，现配现用取不同开花时期的新鲜雌蕊柱头，放入培养皿中，加入检测液使之没过柱头，反应10 min在体视显微镜下观察气泡产生情况以及柱头变色情况1.3 数据处理数据采用Microsoft office 2010及GraphPad Prism 8分析软件进行分析作图2 结果与分析2.1 多花指甲兰花粉电镜扫描结果与其他形态和生理特征相比，花粉形态保持相对稳定，因此花粉形态可以作为更好的分类和系统发育标记[14-15]多花指甲兰花粉团附着于有柄的粘盘上，花粉呈黄色，蜡质，2个在扫描电镜下可以清晰的观察到每个具半裂的裂隙，表面稍有凹陷，无纹饰，近球形（图2A），粘盘柄狭长，粘盘较宽（图3A）每个花粉团均由大量形状不规则花粉粒通过类脂质粘合而成由图2～图4和表1可知，随着开花时间延长，花粉粒皱缩，体积变小，整个花粉团体积也相应变小，花粉团表面变得更加紧密平滑尤其是开花10d后时，即衰败期，花粉粒表面致密平滑2.2 不同开花时期花粉的活力测定研究发现，多花指甲兰最佳染色时长为12h。

实验结果表明，TTC染色液和醋酸洋红染色效果最接近离体萌发结果，而I2-KI染液会使整个视野变红，不利于观测;开花4～6d的花粉染色效果最好，颜色最深，染色率最高（图5），花蕾期染色较浅，呈粉红色，且染色数目较少，开花10d的花粉几乎无法染色，染色极浅整个花期花粉活力先上升到达最高值，之后下降，呈先升后降趋势2.3 不同开花时期柱头可授性研究结果利用联苯胺-过氧化氢法测定多花指甲兰柱头可授性（表2），结果显示3个时期的柱头在检测液中均冒出气泡，其中盛花期过氧化氢酶含量最高，气泡量最大，冒出最迅速，可授性最强花蕾期次之;衰败期最少最缓慢，可授性最弱;但3个时期的柱头均未变色3 讨论花粉为植物的生殖细胞，它能反映物种演化的一般规律，花粉的性状相对稳定，其微观态结构具有种间特异性，是植物分类的重要依据之一[17-20]蘭科植物花粉不同于其他植物，兰科植物花粉由成千上万的花粉粒通过类脂质集合而成花粉粒由四分体组成的，四分体是构成花粉的基本单位不同种属兰花花粉形态、表面纹饰不一如蝴蝶兰花粉块为梨形，中间有大缝隙，花粉块可分为两半[12];杓兰属花粉表面都有圆形凹陷，外壁结构呈光滑或褶皱状[21]。

多花指甲兰花粉近球形，表面具裂。