动物细胞工程制药.ppt

第三章 动物细胞工程制药微生物与生化制药实验室张革第一节 概述一、动物细胞工程的发展简史Ø1907年，Harrison首先培养了神经管 区细胞，并观察到从中长出的轴突细 胞(神经纤维)，他的工作被认为是动 物细胞培养开始的标志Ø1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对 于细胞培养的生长促进作用，并首次 把无菌技术引入细胞培养技术中Ø1950年后Earle等分别建立了Hela等多 种细胞系(cell line)Ø动物细胞培养从50年代起步，已成为普遍技术Ø新的核酸技术，免疫，电泳等技术使细胞培养技 术从细胞水平进入分子水平Ø1986年，传代细胞Namalwa（Burkitt‘s 淋巴瘤细胞） 生产的干扰素批准临床Ø猴肾细胞Vero生产疫苗Ø1987年，杂交瘤细胞生产抗体Ø1988年后，传代细胞生产基因工程产品t-PA、EPO 、VIII二、动物细胞工程制药的基本概念（一）动物细胞工程制药Ø目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生 产的已超过80% ，例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等Ø动物细胞工程制药包括：ü培养细胞获得多肽和蛋白药物ü转基因动物生产疫苗，多肽和蛋白药物动物细胞培养的产物 疫苗人小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫 苗、疱疹疫苗等动物牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎 疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗 、 单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂β-细胞生长因子、INT、白细胞活化因子、血清 胸腺因子、IL、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶uPA、Asn酶、胶原酶、P450、纤维蛋白溶酶原激 活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Tyr脱羟酶等激素HCG、EPO、促滤泡激素、GH、促间质细胞激素、 促黄体激素等Ø动物细胞工程制药所涉及的主要技术领域包括细 胞融合技术、细胞核移植技术、动物细胞反应器 ，动物克隆，染色体改造，基因转移，转基因动 物技术和细胞大规模培养技术等方面Ø最基本的有细胞融合技术、转基因动物技术和细 胞大规模培养技术三项技术Ø（二）动物细胞的分类ü1. 贴壁依赖性细胞:包括成纤维细胞型，上皮细胞型。

生长于支持物表面上皮细胞型成纤维细胞型ü2. 非贴壁依赖性•也称悬浮细胞•这类细胞培养时不贴附于 支持物上，可在培养液中 悬浮生长来源于血液、 淋巴组织，许多肿瘤细胞 等均属于此类细胞一般 呈圆形 悬浮细胞ü3.兼性贴壁细胞•有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可 以悬浮培养如中国仓 鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞兼性贴壁细胞Ø（二）动物细胞培养的环境条件ü1.温度ü2.Ph7.2-7.4 酚红ü3. 通氧量，需CO2ü4.防治污染支原体、抗生素ü5.基本营养物质ü6.渗透压Ø（三）动物细胞的培养特征ü1.比微生物细胞大，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差ü2.倍增时间长，生长缓慢，易污染，培养时添加抗生素ü3.培养基要求高，易污染ü4.培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在ü5.产物分泌性ü6.蛋白后修饰动植物细胞培养与微生物培养性能的相比项项目哺乳动动物细细胞植物细细胞微生物细细胞 大小[μm]悬悬浮生长长营营养要求倍增时间时间 [h] 细细胞分化环环境的敏感性产产物存在产产物浓浓度（%）产产物种类类10～100可以，多采用贴贴壁很复杂杂15～100有非常敏感胞内或胞外低疫苗、激素、抗体、生长长因子、免疫调节剂调节剂 等10～100可以，但细细胞易聚集复杂杂15～100有限分化敏感胞内低酶、生物碱、天然色素、有机化合物等1～10可以简单简单0.5～5无一般胞内或胞外高发发酵食品、抗生素、有机化合物、酶细胞培养基本技术1.原代培养p（1）组织块培养法p（2）单层细胞培养法动物胚胎或幼龄动物 的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞 悬浮 液10代 细胞部分细胞“癌变” ，无限传代动物细胞培养不能 最终培养成动物体50代细胞原代培养传代培养细胞贴壁剥离、分瓶细胞株细胞细胞系2.传代培养3.克隆培养饲养细胞细胞的冻存与复苏l在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止， 即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。

l低温保存的关键：在于通过0~-20℃阶段的处 理过程 在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致 细胞的严重损伤 冻存和复苏的原则：慢冻快融p当细胞冷到零度以下：形成冰晶p如果缓慢冷冻，逐步脱水，不致产生大的冰晶p复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶， 即冰晶的重结晶p常用的低温保护剂是DMSO，提高胞膜对水的通透性， 降低冰点，减少胞内冰晶，第二节 生产用动物细胞一、生产用动物细胞的获得（一）非基因工程细胞的获得Ø1.原代细胞(primary cell)ü直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而 获得的细胞悬液ü1g组织约有109个细胞ü增殖能力有限，需要大量的动物才能增加产量， 费钱费劳力, 限制了它的应用ü动物细胞生产生物药品的早期，一般用原代培养 的细胞来生产疫苗，如鸡胚细胞、原代兔肾细胞 、鼠肾细胞、淋巴细胞等ü适合药物检测Ø2.传代细胞系(passage cell)ü原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成 分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细 胞株(continuous cell lines, CCL)ü染色体组型是2n的核型,二倍体细胞系ü具有贴壁依赖和接触抑制的特性ü有限的增殖能力，50代ü无致瘤性ü一般从胚胎中获得，有限传代üWI-38, MRC-5, 2BS等。

üWI-38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系ü传代细胞在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之 处, 有时是从肿瘤细胞衍生而来, 由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性, 因而数十年间未 允许传代细胞用于生产70年代以后，大量研究工 作证实了二倍体细胞的安全性ü现在CCL已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但 仍不是理想的生产细胞系Ø3. 转化细胞系(transformant cell)l通过某个转化过程形成的，失去正常细胞的特点 由于染色体的断裂变成异倍体，获得无限增殖 的能力ü自发的：正常细胞中自发的转化形成有无限生 命力的细胞系；多发生于啮齿类细胞动物ü人为转化：采用某些病毒SV40或某些化学试剂ü从动物肿瘤组织中建立的细胞系Ø转化细胞为永生化细胞，无限细胞系，连续细胞 系Ø转化细胞具有无限生命力，倍增时间短，对培养 条件和生长因子等要求低，更适于大规模工业化 生产Ø在生物制药中，可通过改造宿主细胞特性，如延 长细胞周期, 提高工程细胞原始表达水平等来提高药物的产量ØNamalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞二）基因工程细胞系的构建Ø在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞，和采用基因工程手段构建的各种工程细胞Ø基因工程细胞系：用基因工程技术或细胞融合技术 对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系Ø分杂种细胞(hybrid cell)和重组细胞 (reconstituted cell)l（1）杂种细胞的构建：通过细胞融合技术构建的ü动物细胞融合：合并为双核和多核细胞的过程ü不同基因型的细胞融合为异核体 (heterokaryon)ü核体经有丝分裂和染色体重排，可形成具有新 的遗传性状的单核杂种细胞，合核体 (synkaryon)(1)细胞融合（cell fusion）：Ø正常情况下，因有完整的细胞膜，两个接触的细 胞不发生融合Ø诱导物可导致细胞融合：ü仙台病毒ü聚乙二醇ü物理方法：电击法，激光法仙台病毒融合法Ø仙台病毒属于副黏病毒科，副流感病毒I型，RNA 病毒Ø病毒表面有神经氨酸酶，降解细胞膜上的糖蛋白 ，使细胞粘在病毒周围，细胞互相渗透，融合Ø目前很少使用聚乙二醇融合法ØPEG结构式：HOH2C(CH2OCH2)nCH2OHØ分子量200-6，000Ø常用分子量1000，浓度50%，pH8.0-8.2Ø原理： 50%的PEG，与临近膜的水相结合，导致双 脂层的不稳定，使膜发生融合Ø主要用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备电融合法Ø细胞在短时间的强电场作用下，膜发生可逆性的 电击穿，使相邻细胞的膜发生继发性融合Ø操作简便、无化学毒性、细胞损伤小、融合同步 、融合率高Ø可比PEG高10-20倍Ø可在显微镜下直接观察融合过程Ø用于小鼠骨髓瘤细胞的融合，构建大量生产人源 单克隆抗体的淋巴杂交瘤细胞株Ø还可用于真核细胞与原核细胞、动物细胞与植物 细胞的融合（2）杂种细胞筛选Ø细胞融合后，除目的杂种细胞外，还有同合体细 胞和未融合的亲本细胞Ø筛选方法：ü（1）营养缺陷型细胞系或抗性细胞系作为融合 的亲本细胞，选择培养基来筛选ü（2）利用或人为制造两个亲本细胞的物理差异 ，如大小，密度等进行筛选ü（3）利用或人为制造杂种细胞与未融合细胞生 化或分生能力的差异，进行筛选2.重组细胞的构建（基因工程细胞系）Ø在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞， 和采用基因工程手段构建的各种工程细胞Ø包括CHO，BHK-21,SP2/0，Vero细胞等Ø最多用的是CHOØ目前用重组DNA术改造的CHO细胞生产INF、IL、 EPO、单抗以及protein药品已成为国际医药市场 上的热销产品，但这些产品的生产规模普遍较小( 大多为5-50L的小型罐)Ø（1） 表达载体的构建外源基因在动物细胞中高效表达，首先要将其构建在高效表达载体内，表达载体两类：üa.病毒载体，牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒 和杆状病毒 üb.质粒载体——穿梭质粒载体a.病毒载体p牛痘病毒载体：大容量，广泛地用来构建多价疫苗(重组牛痘多价活疫苗)。

表达外源性病毒抗原基因，如：HAV、HBV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV，狂犬病毒等抗原基因，经基因重组后而制成的牛痘苗病毒p腺病毒载体和反转录病毒载体：正被适用于基因治疗中p杆状病毒载体：可感染多种哺乳动物细胞，生物 安全度高，已成功地用于300多种外源基因的高 效表达用杆状病毒进行蛋白质的高效表达b. 质粒载体Ø穿梭质粒:能在两种或两种以上宿主中复制的质粒 Ø基本成分：ü允许载体在细菌内扩增的质粒序列，包括起始位点和抗生 素标记基因序列；ü能使基因表达的调控元件，包括TATA box，CAAT box和增 强子，终止序列、3’端切割序列和polyA序列；ü选择标记，一类是仅适用于密切相关的突变细胞株，一类 是显性作用基因，如新霉素抗性基因(neo);ü带有选择性增加拷贝数的扩增系统，常用的是二氢叶酸还 原酶系统，谷氨酰胺合成酶系统和腺苷脱氨酶系统2）基因载体的导入和 高效表达工程细胞株的筛选DNA-磷酸钙沉淀法p溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA—磷酸钙共沉 淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作 用而将DNA导入。

Na2HPO4溶液+溶解的DNACaCl2 溶液逐渐加入磷酸钙沉淀DNA被包裹 在沉淀中DNA磷酸钙共沉淀物通过细胞吞噬作用将DNA导入优点： 方法简单 可进行共转化 廉价电穿孔法电穿孔仪产生高压脉冲电场细胞膜出现瞬时可逆性小孔外源DNA沿着小孔进入细胞优点：转染效率高缺点：进入细胞的DNA拷贝数较低最佳条件：电场强度、脉冲形状、电穿孔介质等筛选Ø外源基因导入效率很低，必须从大量的细胞中 进行筛选Ø利用选择标记，采取相应的筛选系统：üNeor: G418ütk+：胸腺嘧啶激酶ühgprt+：次黄嘌呤营养缺陷型受体细胞第四节、制药工业中常用的动物细胞ØFDA规定：除原代细胞外，其他细胞株或细胞系一 旦建成后必须进细胞库保存Ø工程细胞必须建立ü 原始细胞库(master cell bank, MCB) ：单一来源的 均质细胞Ø原始细胞库所有细胞必须建立档案（细胞系历史）， 进行无菌，无交叉污染和各种有害因子（细菌、真菌 、支原体和各种病毒，包括反转录病毒等）的检测ü生产细胞库（manufacturer’s cell bank, MWCB, 工作细胞库)：从MC。