咳嗽飞沫核携带病毒在病房机械通风条件下经空气传播的人工模拟技术研究.docx

咳嗽飞沫核携带病毒在病房机械通风条件下经空气传播的人工模拟技术研究呼吸道传染病患者咳嗽、打喷嚏等动作可以释放出大量含有致病微生物的唾液颗粒,较大粒径的唾液颗粒成为飞沫,随呼出气流污染周边环境物体表面,较小粒径的唾液颗粒在室内空气中迅速蒸发至平衡状态,成为更小粒径的飞沫核,形成呼吸道传染病空气传播的来源[1]研究[2]显示,初始粒径45μm以下唾液颗粒在室内环境下都有成为呼吸道传染病空气传播的飞沫核,被易感人群吸入并引起感染发生的可能唾液颗粒飞沫核是否引起继发感染还取决于所携带的致病微生物的种类、数量、生物活性、室内微小气候及易感人群个体状况等因素由于生物安全方面的原因,唾液颗粒飞沫核携带致病微生物经空气传播并导致感染的过程无法在实地研究中重现,如能将使用小型人工气候舱对噬菌体悬浮液滴生物活性进行研究[3,4,5]的方法应用到实地研究领域,将显著改善经空气传播传染病的防控及应用技术[6]本研究在成功使用具有唾液相似非挥发性组分模拟唾液,采用可控方式制造出与咳嗽呼出唾液颗粒具有类似粒径分布的液滴谱系的基础上[7],在模拟唾液中加入生物安全等级Ⅰ级的大肠埃希菌噬菌体T1,在病房机械通风条件下模拟唾液雾化,人工模拟咳嗽产生的飞沫,采集空气中标本检测大肠埃希菌噬菌体T1,研究咳嗽产生的飞沫核在病房内经空气传播后携带病毒的存活量,以建立评估呼吸道传染病在病房内经空气传播引起感染风险的现场试验研究方法。

1、材料与方法1.1试验设施设备现场试验在医院病房内进行,病房大小为6.6m×5.9m×2.35m(长×宽×高),采用机械通风方式,室内气流组织形式为典型顶送顶回形式(见图1),两个四向散流送风口及两个回风口均对称设置在病房吊顶上,送风口及回风口大小均为0.6m×0.6m,试验中病房总送风量设定为1060m3/h,约相当于换气11.6次/h,或每换气1次需要311s,室内温度控制在21.5℃,湿度为60.0%图1现场试验中医院病房大小及送回风口位置示意图模拟唾液由30g胰蛋白胨大豆肉汤粉末(OxoidCM0129)、58g胰蛋白胨(OxoidLP0042)粉末加1L蒸馏水配制而成,具有与人体唾液相近含量的非挥发性物质[8]模拟唾液雾化装置由压缩空气瓶、装有模拟唾液的压力罐(SprayingSystems,22140-2-304SS)、管线、气路流量计(GILMONTAccucal○R)、液路流量计(Cole-Parmer○R)、计时电子触发开关(SprayingSystems,11438-21A)和雾化喷嘴(SpraySystemInc.,B1/4JN+SU1A)等组成,与相关研究[7]使用的雾化装置相同。

现场试验中雾化点选择在病房的几何中心点,雾化喷嘴安置在距离病房地面高度0.8m,喷嘴方向垂直朝上,模拟患者躺在病床上并向上咳嗽现场试验中雾化喷嘴由计时电子触发开关控制,每次喷雾1s以模拟1次咳嗽,试验中将压缩空气流量控制在0.4L/min,模拟唾液流量控制在0.3mL/s,使每次喷雾排出的气体量与一次咳嗽排出的气体量[9,10]相近为能采集到足够数量的不同粒径段雾化液滴用于统计分析,每次雾化的模拟唾液量约为咳嗽产生飞沫液体量[11]的8倍,相当于同时咳嗽8次每次喷雾后使用粒子计数器(GRIMMmodel1.108)记录检测点不同粒径段空气粒子数量变化数据粒子计数器经过厂商检定,检测粒径范围为0.3～20μm,并被分成16个粒径段分别记录统计每次喷雾后收集检测点粒子数量变化数据360s,与病房空气1次换气所需时间相当由于病房机械通风系统的回风管路安装了高效过滤器,因此,假定喷雾产生的粒子不能通过机械通风系统循环进入病房空气中,而试验中病房与外环境的空气交换只能通过机械通风系统喷雾形成的液滴所携带的大肠埃希菌噬菌体通过使用400孔单级安德森采样器(SKCQuickTake-30)在检测点采集空气标本获得。

试验中单极安德森采样器由电控开关控制,采集粒径范围0.65～23μm的雾化液滴安德森采样器经过厂家检定和实验室校准,采样空气流量稳定在28.3L/min每次喷雾后在每个检测点连续采集6次空气标本,每次采样持续1min采样过程中安德森采样器内安放1只在实验室预先配制的培养皿,采样后培养皿立即送实验室进行培养检测在病房一角四分之一区域完成,控制及喷雾装备设置在检测区域对角区域,以减少对试验的干扰,采样人员佩戴呼吸器以避免吸入雾化颗粒试验中病房内除试验装备外未设置病床和医疗设备等其他物品,使雾化液滴在病房空气中的扩散仅受机械通风气流的影响.试验过程共设置4个检测点,离喷嘴的水平距离均为2m,各检测点在坐标中相对位置如图2所示,其中P1和P2点位于送风口下方,离病房地面高度分别为1.7、1.1m,P3和P4点位于回风口下方,离病房地面高度分别为1.7、1.1m检测点离病房地面高度的选择是模拟访客站立或坐下时的呼吸带高度图2现场试验医院病房检测点位置平面示意图1.2大肠埃希菌噬菌体模拟唾液及空气采样平皿的制备大肠埃希菌噬菌体模拟唾液的制备:将配制好的1L模拟唾液肉汤121℃高压蒸汽灭菌15min,冷却至室温后加入少量大肠埃希菌冻干粉(ATCC11303),置37℃恒温水浴摇床中培养8h,取1/4含菌肉汤用于安德森采样器培养皿制作,在其余含菌肉汤中加入大肠埃希菌噬菌体(ATCC11303-B1,为冷冻成品)后置37℃恒温水浴摇床中再培养8h,待大肠埃希菌噬菌体充分复制后加入试管中离心,离心后取上清液使用0.22μm的滤膜过滤,滤液中大肠埃希菌噬菌体含量经浓度滴定检测达到108PFU/mL时,置4℃保存备用。

每次现场喷雾试验前后都对模拟唾液肉汤中的大肠埃希菌噬菌体含量进行浓度滴定检测,以计算雾化液滴中初始大肠埃希菌噬菌体携带量空气采样平皿的制备:安德森采样器培养皿内包含软琼脂和基层琼脂双层琼脂,双层琼脂的组分及含量见表1配制中先将基层琼脂加入1L蒸馏水中,121℃高压蒸汽灭菌15min,取灭菌平皿,每皿倒入基层琼脂10mL,置室温中待基层琼脂凝固将软琼脂加入1L蒸馏水,121℃高压蒸汽灭菌15min,冷却至45℃,将软琼脂装入10mL的灭菌试管,每支试管内加入0.5mL制作大肠埃希菌噬菌体模拟唾液中留取的含菌肉汤,再倒入含基层琼脂培养皿内,摇动培养皿以使软琼脂均匀覆盖基层琼脂表面,待软琼脂凝固将培养皿用于现场空气采样每次采样后的培养皿于37℃培养8h,采样过程中雾化液滴携带大肠埃希菌噬菌体沉降在培养皿软琼脂上并侵入大肠埃希菌宿主细胞进行复制,培养过程中宿主细胞死亡后细胞壁破裂释放大量新噬菌体,继续侵蚀周边大肠埃希菌细胞并最终在培养皿软琼脂表面形成空斑,因此雾化液滴经空气扩散后所携带的大肠埃希菌噬菌体数量可以通过计算空气采样培养皿软琼脂表面的空斑数量获得由于自然空气没有大肠埃希菌噬菌体,空气中大肠埃希菌噬菌体本底数量可以忽略不计。

1.3雾化液滴蒸发平衡后液滴核的粒径计算在典型室内空气相对湿度范围内,呼吸道分泌物由于含有糖蛋白和无机盐离子,其雾化液滴经蒸发作用后仍保留一定比例的水份,此时液滴表面水汽蒸发和凝结作用达到平衡形成液滴核雾化液滴表面蒸发速率可以通过经典液滴表面边界层水汽压平衡扩散梯度公式计算[12],雾化液滴粒径变化时间函数d(t)表达如下:表1空气采样器培养皿内培养基组分及含量式中d0是雾化液滴初始直径,D是水汽分子扩散率,M是水的分子量,R是通用气体常数,ρ是空气密度,T是空气温度,P∞是空气中的水汽压,Ps是饱和水汽压由于雾化液滴非挥发性物质组分较为复杂,公式(1)中的热力学参数难以确定,使用质量平衡原理假定完全脱水的液滴与其初始状态的非挥发性物质的质量相同,蒸发平衡状态的液滴核粒径(deq)与其初始粒径(d0)关系的简化计算方法如下[11]:式中Cn是呼吸道分泌物中非挥发性物质的质量浓度,Cn=88g/L[8],如果使用水的密度ρn=1000g/L代表雾化液滴蒸发平衡时的密度[11],咳嗽呼出飞沫蒸发平衡后的直径约为初始直径的0.44倍,此项假设建立在纯水颗粒蒸发的基础之上,未考虑飞沫中非挥发性物质对粒径变化的影响[1],对于雾化液滴蒸发平衡后液滴核的粒径计算,进而计算液滴核所携带大肠埃希菌噬菌体存活函数有一定影响。

1.4数据统计分析使用SigmaplotV11(SPSSInc)统计分析数据2、结果2.1蒸发作用下雾化液滴的粒径变化本研究假设雾化液滴蒸发平衡后液滴核的粒径是初始粒径的0.4倍,则液滴核的体积是雾化液滴初始体积的6%,按此假设咳嗽飞沫不同粒径段颗粒的平均粒径及其蒸发平衡后的粒径见表2表2咳嗽飞沫不同粒径段数量[12]及其蒸发前后平均粒径2.2空气中液滴核数量可吸入粒径范围的液滴核达到蒸发平衡所需要的时间很短,如按照公式(1)计算45μm初始粒径的水滴完成蒸发的时间小于1s蒸发平衡后空气中的液滴核在重力沉降、与其他空气悬浮粒子凝结或机械通风系统作用下去除计算检测到的液滴核数量时还要剔除空气中本底粒子数,每次现场试验前使用粒子计数器记录10min内病房空气中本底粒子数量变化,检测结果显示病房空气中本底粒子的平均粒径是0.84μm,本底粒子浓度是58725个/L在图2检测点粒子计数器记录的空气粒子数减去空气本底粒子数后即为该检测点的液滴核数量图3试验病房空气中不同粒径段本底粒子数2.3可吸入液滴核的体积计算选取检测点粒子计数器记录的安德森采样器测量粒径范围内的不同粒径段的粒子数,分别减去对应粒径段的空气本底粒子数,获得不同粒径段液滴核的数量,再将液滴核粒径反推蒸发前雾化液滴初始粒径,在任意检测点(Xj)液滴核蒸发前每升空气中雾化液滴的总体积密度函数(Vt,mL)计算如下:式中ci是空气中特定粒径段液滴核的粒子浓度,vi是特定粒径段液滴核蒸发前的雾化液滴体积,i代表任意粒径段,n是粒径段总数,j代表任意检测点。

2.4空气标本中噬菌体存活量为验证喷雾机械力对液滴中噬菌体存活的影响,由计时电子触发开关控制雾化喷嘴向无菌烧瓶内喷雾1s,采集烧瓶内凝结液进行噬菌体浓度滴定检测,结果显示喷雾前后噬菌体浓度在相同数量级,表明喷雾机械力对液滴中噬菌体存活影响可以忽略不计,造成液滴核内噬菌体数量减少的主要因素是干燥和环境参数现场试验中4个检测点空气标本中噬菌体存活数量随采样时间衰减变化特征符合回归曲线,将回归曲线延伸至t=0处推算液滴核初始携带的噬菌体数量N0,xj,检测点噬菌体存活百分比可以通过空气标本中活噬菌体数量(Nt,xj)除以N0,xj计算结果显示四个检测点在采样的第一分钟内损失了40%～80%的噬菌体,各检测点噬菌体数量的衰减变化规律符合对数衰减特征,与机械通风条件下空气粒子数量的衰减特征一致图4空气标本中存活噬菌体的数量衰减变化2.5病房空间噬菌体存活函数公式(3)计算获得的任意检测点(Xj)液滴核蒸发前每升空气中雾化液滴的总体积密度函数Vt,xj与模拟唾液中噬菌体浓度(C0,个/mL)的乘积就是任意检测点液滴核初始携带的噬菌体数量(Mt,xj),即:（公式）比较通过延伸液滴核噬菌体数量对数衰减曲线至t=0处获得的初始噬菌体数量和公式(4)的计算结果发现,在P1检测点液滴核中约83%的噬菌体在t=0处死亡,说明蒸发过程中液滴内理化指标的快速变化对噬菌体存活造成重大影响。

P1检测点空气样品中噬菌体数量随采样时间衰减及其对应的公式(4)计算结果见图5,其中液滴核噬菌体存活数量以正常对数表示,两组数据与两条线性回归曲线吻合,其最小平方相关系数分别为0.90和0.91图5P1检测点空气粒子数推算噬菌体初始量及空气标本检测结果图5中两条线性回归曲线的的斜率相同,说明检测点液滴核内存活噬菌体数量的衰减率与由公式(4)计算获得的液滴核初始携带的噬菌体数量的衰减。