第十五章：酵母菌基因工程选编课件.ppt

第十五章第十五章 酵母菌基因工程酵母菌基因工程酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式进行酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物共有无性繁殖的单细胞真核生物共有5656属和属和500500多个种组成酵母是最成熟的多个种组成酵母是最成熟的真核生物表达系统真核生物表达系统第一节第一节 简介简介1发展历程发展历程1.1.19741974，Rlarck-walkerRlarck-walker和和MiklosMiklos发现发现在大多数酵母中存在质粒在大多数酵母中存在质粒2.2.19781978，HmnenHmnen将来自一株酿酒酵母的将来自一株酿酒酵母的leu 2leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的补了后者的Leu2Leu2缺陷，标志着酵母表缺陷，标志着酵母表达系统的建立达系统的建立3.3.19811981，HinnenHinnen等用酵母基因表达系统等用酵母基因表达系统表达了人干扰素表达了人干扰素4.4.19831983，我国首次用酵母菌表达了乙型，我国首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因肝炎病毒表面抗原基因5.5.19961996，完成了第一个真核生物，完成了第一个真核生物酿酿酒酵母全基因组的测序。

酒酵母全基因组的测序2酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统1.优势在于：优势在于：安全无毒，不致病；安全无毒，不致病；有较清楚的遗传背景，容易进行遗有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；传操作；易进行载体易进行载体DNADNA的导入DNADNA转化技转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；以取得较高的转化率；培养条件简单，容易进行高密度培养条件简单，容易进行高密度发酵；发酵；能将外源基因表达产物分泌到培能将外源基因表达产物分泌到培养基中；养基中；有类似高等真核生物的蛋白质翻有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能译后的修饰功能2.缺陷在于：缺陷在于：表达效率相对低；表达效率相对低；酵母常有密码子偏爱性，真核基酵母常有密码子偏爱性，真核基因在其中表达时需要人工修正因在其中表达时需要人工修正3酵母基因工程的发展现状酵母基因工程的发展现状目前酵母基因工程中发展和应用较多目前酵母基因工程中发展和应用较多有酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母等，其有酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母等，其应用主要体现在以下两方面：应用主要体现在以下两方面：1.酿酒酵母的自身改造：酿酒酵母的自身改造：将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母（可自身分泌葡萄糖淀粉酶）。

可自身分泌葡萄糖淀粉酶）将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母（可自身分泌蛋白水解酶）母（可自身分泌蛋白水解酶）将将- -葡聚糖酶基因导入酿酒酵母葡聚糖酶基因导入酿酒酵母（可有效降解麦芽汁中的（可有效降解麦芽汁中的- -葡聚葡聚糖，改善啤酒的过滤效率）糖，改善啤酒的过滤效率）将将ATPATP硫酸化酶和腺苷酸硫酸激酶硫酸化酶和腺苷酸硫酸激酶在酿酒酵母体内表达（促进在酿酒酵母体内表达（促进SOSO2 2的生的生成，维持啤酒风味的稳定）成，维持啤酒风味的稳定）将人血清清蛋白（将人血清清蛋白（HASHAS）基因转化）基因转化到酿酒酵母（生产出富含到酿酒酵母（生产出富含HASHAS的啤的啤酒新品种）酒新品种）2.2.酵母表达异源蛋白酵母表达异源蛋白表达水平表达水平: :酵母表达系统主要用酵母表达系统主要用于表达外源基因，表达水平的高于表达外源基因，表达水平的高低直接关系到其应用价值酵母低直接关系到其应用价值酵母的高效表达从三方面实现：的高效表达从三方面实现：A.A.通过开发高效的启动子提高和控制通过开发高效的启动子提高和控制外源基因的转录水平外源基因的转录水平B.B.提高表达载体在细胞中的稳定性。

提高表达载体在细胞中的稳定性C.C.通过多次同源重组以及通过多次同源重组以及rDNArDNA介导的介导的整合两种方式提高表达基因在细胞整合两种方式提高表达基因在细胞中的拷贝数中的拷贝数表达质量：除表达水平外，外源表达质量：除表达水平外，外源基因表达质量的好坏也直接关系基因表达质量的好坏也直接关系到酵母表达系统的应用价值到酵母表达系统的应用价值3.酵母基因工程的发展趋势酵母基因工程的发展趋势解决酵母基因工程中还存在的缺解决酵母基因工程中还存在的缺陷；陷；在人类基因组计划中的应用研究在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向；是一个重要的发展方向；利用酵母基因工程筛选更多的制利用酵母基因工程筛选更多的制药；药；改造酿酒酵母自身，降低生产酒改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本；精的成本；酵母的生理承受极限研究将引起酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注人们的关注广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌 第二节、酵母菌的宿主系统第二节、酵母菌的宿主系统1广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想 属名属名 举例举例酵母属酵母属 酿酒酵母酿酒酵母克鲁维酵母属克鲁维酵母属 乳酸克鲁维酵母乳酸克鲁维酵母毕赤酵母属毕赤酵母属 巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母裂殖酵母属裂殖酵母属 非洲酒裂殖酵母非洲酒裂殖酵母汉逊酵母属汉逊酵母属 多态汉逊酵母多态汉逊酵母2提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变利用经典诱变技术筛选分离酿酒酵母的核突变株或细利用经典诱变技术筛选分离酿酒酵母的核突变株或细胞质突变株，可以提高重组异源蛋白在酵母菌中的合胞质突变株，可以提高重组异源蛋白在酵母菌中的合成产率。

然而，有些在表型上能提高某种特定异源蛋成产率然而，有些在表型上能提高某种特定异源蛋白表达的突变株未必具有促进其它外源基因表达的能白表达的突变株未必具有促进其它外源基因表达的能力，因为提高一种特定异源蛋白合成和分泌的影响因力，因为提高一种特定异源蛋白合成和分泌的影响因素极其复杂，其中包括表达产物本身的生物化学和生素极其复杂，其中包括表达产物本身的生物化学和生物物理特性，只有那些能促进任何外源基因分泌表达物物理特性，只有那些能促进任何外源基因分泌表达的基因型稳定突变株，才能用作理想的基因工程受体的基因型稳定突变株，才能用作理想的基因工程受体细胞 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性整个糖单位由糖基白质的生物活性整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成核心和外侧糖链两部分组成3抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修饰和加工系统对来自高等动物和人的异饰和加工系统对来自高等动物和人的异源蛋白活性表达是极为有利的，但野生源蛋白活性表达是极为有利的，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。

化缺陷菌株非常重要突变类型突变类型 生物效应生物效应 mnn mnn 甘露糖生物合成缺陷型甘露糖生物合成缺陷型 alg alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 och och 外侧糖链添加缺陷型外侧糖链添加缺陷型这些突变菌株不能在异源蛋白的天门冬酰这些突变菌株不能在异源蛋白的天门冬酰胺侧链上延长甘露多聚糖长链，这是酿酒胺侧链上延长甘露多聚糖长链，这是酿酒酵母超糖基化的一种主要形式酵母超糖基化的一种主要形式含有含有mnn9mnn9突变的酵母菌细胞缺少能聚合外侧突变的酵母菌细胞缺少能聚合外侧糖链的糖链的a-1,6-a-1,6-甘露糖基转移酶活性，而甘露糖基转移酶活性，而och1och1突变株则不能产生膜结合型的甘露糖基转移突变株则不能产生膜结合型的甘露糖基转移酶尽管其它类型的突变株尚未进行有效的酶尽管其它类型的突变株尚未进行有效的鉴定，但它们却能使异源蛋白在天门冬酰胺鉴定，但它们却能使异源蛋白在天门冬酰胺侧链上进行有限度的糖基化作用，基本上杜侧链上进行有限度的糖基化作用，基本上杜绝了糖基外链无节制延长的超糖基化副反应绝了糖基外链无节制延长的超糖基化副反应4.4.减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用泛素介导的蛋白质降解作用A.A.第第一一类类基基因因含含有有多多个个泛泛蛋蛋白白因因子子编编码码重重复复序序列列，各各重重复复序序列列头头尾尾相相连连形形成成多拷贝结构；多拷贝结构；酵母菌的泛蛋白因子编码基因分为两大类：酵母菌的泛蛋白因子编码基因分为两大类：B.B.第第二二类类基基因因为为单单一一泛泛蛋蛋白白因因子子编编码码序序列列与与另另一一个个不不相相关关的的多多肽肽编编码码序序列列的的融融合合基基因因，后后者者称称为为羧羧基基延延伸伸蛋蛋白白（CEPCEP），它它也也有有两两种种大大小小不不同同的的序序列列，其其中中CEP52CEP52由由5252个个氨氨基基酸酸残残基基组组成成，而而CEP76-80CEP76-80则由则由76-8076-80个氨基酸残基组成。

个氨基酸残基组成 在酵母菌中共有四个基因编码泛蛋白因子：在酵母菌中共有四个基因编码泛蛋白因子：UBI1UBI1和和UBI2UBI2编码融合蛋白泛蛋白编码融合蛋白泛蛋白-CEP52-CEP52UBI3UBI3编码泛蛋白编码泛蛋白-CEP76-CEP76UBI4UBI4则编码一个五聚体泛蛋白因子则编码一个五聚体泛蛋白因子UBI1UBI1、UBI2UBI2和和UBI3UBI3基因均能在酵母菌对基因均能在酵母菌对数生长期内表达，当菌体进入稳定期后数生长期内表达，当菌体进入稳定期后便自动关闭，便自动关闭，UBI4UBI4的表达时序与前三种的表达时序与前三种基因恰好相反，这说明四种基因编码产基因恰好相反，这说明四种基因编码产物的生物学功能并不完全相同物的生物学功能并不完全相同 A.A.第一类基因包括第一类基因包括UBC4UBC4、UBC5UBC5和和UBC7UBC7，其编，其编码产物只拥有相应的保守结构域，多肽序码产物只拥有相应的保守结构域，多肽序列的其它区域并没有明显的同源性，这些列的其它区域并没有明显的同源性，这些蛋白形成泛蛋白蛋白形成泛蛋白- -靶蛋白共价接合物的活靶蛋白共价接合物的活性严格依赖于性严格依赖于E3E3蛋白的存在；蛋白的存在；几个编码泛蛋白因子接合酶系统的酵母菌基因（几个编码泛蛋白因子接合酶系统的酵母菌基因（UBCUBC）B.B.第二类基因包括第二类基因包括UBC1UBC1、UBC2UBC2、UBC3UBC3和和UBC6UBC6，它们的表达产物具有天然的，它们的表达产物具有天然的C C端端延伸活性，不需要延伸活性，不需要E2E2蛋白的参与便可蛋白的参与便可进行泛蛋白的接合反应。

进行泛蛋白的接合反应 如果外源基因表达产物在酵母菌中如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依赖型降解作用的敏具有对泛蛋白。