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母鸡卵巢中不同等级卵泡的闭锁研究 扈琴吉摘 要：在产蛋高峰期，母鸡的卵巢中含有30～100个卵黄色卵泡，直径在1～8mm之间一般母鸡体内卵泡数量与卵泡直径成反比，例如鸡体内有约20个直径为1～2mm和1个直径为7～8mm的卵泡，直径>8mm的卵泡数约为4～7个本研究通过苏丹黑B染色法发现：鸡卵泡生长至3～5mm大约需要3d，再生长至5～8mm大约需要2d，生长至8mm到排卵需要6d由于染料无法进入较小的卵泡，因此本试验没有检测到1～3mm之间的数据研究也發现鸡体内含有5～25个闭锁卵黄色卵泡，这对于高产鸡是正常现象，但在整个试验中，只观察到一个闭锁的大卵黄色卵泡因此本试验以这两种闭锁水平来定义不同卵泡的大小本研究得出，鸡的排卵率经两种互补机制进行调控，一种促进卵泡在起始阶段的生长，另一种使小卵黄卵泡闭锁，抑制卵泡生长关键词：母鸡；等级卵泡；闭锁1 前言产蛋母鸡的卵巢含数百万个卵泡（Hutt，1949），其中眼观可见的卵泡数高达数千个（Pearl & Schoppe，1921）目前研究主要集中于直径>1mm的卵泡，是因为这些卵泡正处于发育阶段（Marza & Marza，1935），而6mm左右的卵泡容易闭锁（Fell，1923），>8mm的卵泡通常可以发育至约40mm并排卵。

>8mm卵泡的闭锁对于生殖高峰期的禽类来说是罕见的，除非外界环境的应激导致母鸡停止产卵（Erpino，1969，1973；Kern，1972）卵泡的闭锁通常发生于季节性繁殖的禽类，在高产季节到达最高峰然而，只有在卵泡生长阶段才能评估卵泡闭锁对活跃卵巢功能的作用目前，大卵黄卵泡的生长已经被广泛研究，它们被认为是处于“快速增长阶段”且具有等级结构的卵泡（Marza & Marza， 1935；Warren & Conrad，1939；Lacassagne，1957，1960；Smith，1959；Bacon & Skala，1968；Gilbert & Wood-Gush，1971；Gilbert，1972；Oribe，1973）相比之下，母鸡体内100个左右的小卵黄色卵泡几乎未被研究，是因为它们的生长速度差别较大（Romanoff & Romanoff，1949；Griffin，Perry & Gilbert，1983）Marza & Marza（1935）认为卵泡生长到3～6mm大约需要60d，但有研究已经表明卵泡经24h就能生长到4～7mm（Warren & Conrad，1939；Oribe，1973）。

Opel（1958）和Nalbandov（1959，1961）对于卵巢内促卵泡激素（FSH）的水平观察显示，卵泡增长所需的时间介于这两个数值之间注射FSH后几天内就可以增加小卵泡和大卵黄卵泡的数量同样，我们对小卵黄卵泡的观察结果表明，达到相应的数量需要超过24h（Griffin et al.，1983）研究小卵黄卵泡的群体特征对于理解大卵黄卵泡等级结构的形成以及家禽蛋产量是至关重要的因此，我们使用脂溶性染料苏丹黑B标记卵泡的方法，对产蛋高峰期高产母鸡品系进行检测（Warren & Conrad，1939；Bacon & Cherms，1967，1968；Bacon & Skala，1968；Gilbert，1972；Oribe，1973）2 材料与方法将100只母鸡用个体鸡笼进行饲养，使其自由采食和饮水每天照明时间设置为14h（04：30～18：30）两个试验采用相同方法处理2.1 随机选择60只母鸡，每只母鸡在09：00～10：00之间饲喂一个明胶胶囊（大小3号，含有100mg苏丹黑B），饲喂胶囊后放回笼位在预试验中，对饲喂后1、3、7和10d的鸡进行静脉注射过量戊巴比妥钠致死预试验结果发现，本试验选取的时间节点具有统计学意义。

因此，后续试验中每隔1、2、3、4、5和6d致死鸡（6只/组），从卵巢取出直径>8mm的卵泡并计数其余部分将卵巢在盐水中短暂冲洗，并且将所有直径>1mm的卵泡取出并置于10%福尔马林溶液中这种固定方式不会显著影响卵泡的大小（Gilbert，Hardie&Perry，1982）蛋黄变硬后（2～3d固定），检测禽类产生的卵染料是否存在本试验未测量闭锁卵泡，因为无法确定卵泡收缩的程度此外，本试验也检查了经染料处理后的母鸡所产蛋的染色情况2.2 随机选择24只鸡，饲喂含有100mg苏丹黑B的明胶胶囊收集所产的鸡蛋，放置30d后煮沸，蛋黄一分为二，记录染料情况由于存在个别鸡只未能摄取到染料，因此处理的数据与表格中的数据存在差异3 结果3.1 卵泡数量 试验1中分别检查了3种类型的卵泡：直径1～8mm、大于8mm和闭锁卵泡闭锁卵泡表面具有小的出血点，有的甚至出现变形或皱缩的外观在检测的闭锁卵泡中我们观察到卵泡最小直径为1mm，最大直径为1～8mm所有>8mm的卵泡都是可排卵的从本试验研究发现，在含有活性卵泡（1～8 mm）的35只鸡中，有7只鸡的卵泡数达到30～40个，6只鸡有41～50个，8只鸡有51～60个，8只鸡有61～70个，2只鸡有71～80个，2只鸡有81～90个，2只鸡有91～100个；平均每只鸡约有56个卵泡。

此外，该鸡群中闭锁卵泡数量为3～26个不等（1只3个，8只6～10个，12只11～15个，7只16～20个，5只21～25个，2只26个），约占活卵泡数量的27%左右本研究发现，尽管不同鸡体内的活卵泡数（1～8mm）存在一定的差异，但卵泡在各个层析结构中的数量相对恒定，即每个数量等级结构的鸡约集中在5只或6只，很少有4只或7只的存在同样，闭锁卵泡的数量与其他卵泡类别的数量之间没有相关性从表1中发现，有活性的卵泡（1～8mm）随着卵泡直径的增加，卵泡数量稳定下降尽管个体鸡体内较大的卵泡数量较少，但是这种现象在个体间并不明显，因为有超过一半的鸡体内没有7～8mm卵泡，少数鸡有2～4个大卵泡，总体趋势显著3.2 卵泡生长速度 本试验首先在第0天给鸡饲喂单一剂量的苏丹黑B，随后通过确定染色的卵泡在卵巢中生长发育所需要的时间来判断卵黄卵泡的生长速度预试验发现染料进入卵泡的时间不超过24h在第1天，染料大多存在于>3mm的卵泡中，且集中于卵黄的外部区域，并延伸约0.5～1mm的深度在第2天，3～4mm的卵泡中未见染料，或者染色在>5mm卵泡的外层此时，染色模式根据卵泡大小表现出差异在>6mm的卵泡中，染料呈断层存在，在5～6mm的卵泡中染料向卵黄核扩散，4～5mm的卵泡中，整个卵黄被轻微染色。

在本试验所检查的卵黄中发现，较小的卵泡含有轻微染色的卵黄核心，较大的卵泡具有强烈的染色层，在横截面中可见染色环这种差异染色模式反映了4～5mm卵泡在生长阶段中卵黄成分的变化（Marza & Marza，1935），这种改变促进卵黄层的稳定构象（Warren & Conrad，1939）本试验发现，标记的卵泡比例随时间下降；给鸡饲喂苏丹黑B后，第6天未在3～8mm的卵泡中发现染料，第10天，在8～40mm的卵泡中发现少数染料；本研究前期发现卵泡生长到3～8mm大约需要5d时间因此表2和表3的结果与试验1结果相一致三次独立实验在特定时间间隔内进行，表2显示卵泡一般生长模式，表3显示特殊生长模式试验发现，每一只鸡不论在哪个时间段，染色和未染色的卵泡之间都有明显分界该结果表明鸡卵泡的生长是同步的如表3所示，通过测量每个卵巢中最小的染色卵泡或最大的未染色卵泡，可以确定它们从一个大小级别到另一个大小级别的生长速度然而，许多卵泡会演变成闭锁卵泡，并且在演变的早期阶段此类卵泡是无法被检测到，因此该方法会有一定的偏差如果所有已染卵泡随后开始退化，那么这种检测方法会高估卵泡的生长速度，如果演变成闭锁卵泡，则会低估其生长速度。

同樣，如果最大的未标记卵泡演变成闭锁卵泡（如表3中第1天5～6mm中未标记的卵泡）则会高估其生长速度，如果所有未标记的卵泡开始退化，则会低估其生长速度在卵泡生长发育后期会增加这4个错误数据的几率卵巢中闭锁卵泡的再吸收率通过染色时间长度表示在第1天，染色卵泡数量约占闭锁卵泡的一半，有些在第3天仍然明显，到第6天染色的闭锁卵泡消失尽管染色标记的方法仅适用于卵黄的再吸收而不适用于整个卵泡，但试验结果表明，卵巢在几天内会自动消除闭锁卵泡研究显示，在5d内，卵泡演变为闭锁卵泡过程中活卵泡的丢失量约为40%3.3 检测染色鸡蛋 在试验2中，从第0天给予母鸡饲喂单剂量的苏丹黑B染料，通过染色蛋黄的时间估计生长速度不同母鸡产出已染蛋黄是鸡蛋需要9～13d的时间（表4）随后本试验采用Oribe，Kameyama&Kayano（1975）的研究方法显示鸡蛋染料图案的渐进变化，并标明最后一个染色的蛋黄与第一个未染色蛋黄的时间间隔研究发现，染色第2天，在一个狭窄的浅色蛋黄区横截面发现环状染色带连续观察8d（表4），发现染色带从较小染色环演变为不规则形状该结果与之前用于确定快速生长期染料环的结果一致（Warren & Conrad，1939；Lacassagne，1960；Bacon & Skala，1968；Gilbert，1972；Oribe，1973），其中最小的规则染色环内径约为5mm。

随后将鸡蛋放置3d（表4），发现在蛋黄核心4～5mm的直径范围内的染色呈弥散型该3d的统计结果与卵泡从3mm增加至5mm的生长时间相一致（表2和表3）染色蛋的有序生产是该试验的一个前提（至少针对3mm以上的卵泡）因此可以保证在一系列染色蛋中间未发现未染色蛋，反之亦然同样，蛋黄中染色形状的变化趋势也没有中断此外，也未在蛋黄与蛋黄染色环中间发现染色现象4 结论本项研究从多角度阐明了国内母鸡卵巢功能，然而这些研究迄今为止很少被关注本试验虽然只使用了一个母鸡品种，但为与其他产母鸡品种进行比较奠定了基础例如，一项关于肉鸡或火鸡的类似研究可以阐明这些鸡蛋产量相对较差的情况，此外选择一个品种进行研究来确定母鸡是否随着日龄的增加，通过改变体内多项相关代谢机制而引起产蛋量的下降在产蛋高峰期，母鸡的卵巢约含有60个1～8 mm的卵泡然而，本研究发现卵泡数量随着卵泡大小的增加而相应减少从3mm到排卵阶段，卵泡的生长呈连续状态，尽管不同鸡之间存在一定差异，但从以下数据中可以得到近似生长状态：从3mm到5mm，需3d（表4）；从5mm到8mm，需2d（表3和表4）；从8mm到排卵，需6d（表3和表4）由于小于3mm的卵泡不能吸收苏丹黑B染料，因此无法检测1～3mm的卵泡生长速度。

如先前研究发现（Gilbert，1971），小的卵黄色卵泡不构成传统的“池”，也不处于“静止”状态如果处于静止状态，通常发生在直径小于1mm的卵泡中直径>3mm或者>1mm卵泡的生长方式与其他等级结构卵泡的生长方式相同此外，本试验利用更加直观的方式检测到卵泡从3mm生长至8mm大约需要5d的时间，比Marza和Marza（1935）建议的染料时间短，但是超过了24h（Warren & Conrad，1939；Oribe，1973）随着卵泡体积的增加，卵巢中卵泡的数量普遍减少，并且大约50%的母鸡没有7～8mm大小的卵泡这在母鸡体内的较大卵泡中是常见的差异，并且这种差异也调节了鸡的产蛋率（Warren & Conrad，1939；Lacassagne，1960；Gilbert & Wood-Gush，1971；Gilbert，1972）然而，本试验发现约有80%甚至更高比例的此类母鸡，可能是因为卵泡在7～8mm级别时的存在时间不超过1d评价卵巢功能的一个重要的指标是对闭锁小卵黄色卵泡进行量化在以前的报道中，虽然已经认识到卵泡闭锁是禽类卵巢的一个共性，但却并未给出相关信息（Dubuisson，1906；。