抗原结合片段(Fab)抗体制备技术.doc

抗原结合片段(Fab)抗体制备技术一、 原理基因工程抗休技术的基本原理是，首先从杂交瘤细胞、免疫脾细胞或外周血淋巴细胞中提纯mRNA,逆转录为cDNA,再经PCR分别扩增抗体的重链和轻链可变区编编码基因，经适当方式 将二者连接形成单链抗体刊变区基因片段(single chain variable fragments, ScFv),在一定的表达系统中得以表达另外，重链和轻链可变区基因还能在同一•宿主的两个载体中分别表达，然后在胞浆内组装成单链抗体可变区片段(ScFv),或二价抗体片段这种单链抗体在其N末端或C末端可进一步与毒素、葡萄球菌蛋白A、碱性磷酸酶、T细胞 受体及单链抗体片段本身融合，这些蛋白质既有抗原结合能力，又有其融合蛋白的生物活性，因此这类蛋白被称为“双功能抗体”二、 材料、方法和结果(一) 淋巴细胞的分离纯化1从小鼠脾脏分离制备淋巴细胞(1) 将小鼠脾脏从小鼠腹腔取出,用0 02mol/L pH值7 4 PBS (Hank/ s液,无血清1640 液均可)洗涤外表而，去掉周围脂肪组织，置于200目不锈钢网膜中，此网膜事先放在一个高压 后的平皿中，平皿中加入10ml PBS或Hank, s液或1640液。

⑵用5ml或10ml注射器中的针柄轻轻研磨脾脏，使淋巴细胞通过网膜流入平IIIL中，|何取出 余下的深白色的脾包膜层⑶加入PBS10^15ml轻轻冲洗网膜及平皿，取出网膜，用毛细吸管轻轻吹打均匀，置于15m1离心管中4) 置离心机中， 1 500〜2 000 r/min,室温离心lOmin,弃上清5) 用PBS 8ml重悬细胞沉淀，分装入8个Eppendorf管中， 1 500〜2 000 r/min离心，将细胞沉淀放置冰浴或存放-70°C以备用注意：此步关键是将脾脏组织捣碎，使脾细胞组织块分成单个细胞，以利于RNA提取2 从人外周血或骨髄中分离淋巴细胞(1) 抽取抗凝血或骨髓,每毫升血加入5单位肝素,一般建库需要30~40ml血或10ml骨髓2) 用等最Hankz s液或PBS稀释外周血，如使用骨髓可用15倍量稀释3) 为了分离血中的淋巴细胞，首先在各试管中(10~15ml试管)加入3ml淋巴细胞分离液(上 海生化试剂厂)或进口分离液Fico 11 Plaque (Pharmacia 10 A001 07),然后于每个试管中从管壁轻轻加入5ml稀释后的血液4) 置低速台式离心机， 2 500 r/min,离心20min。

5) 此时可见试管中不同组分的条带，从上至下分别为血浆层(黄色)，淋巴细胞层(口色)， 分离液(无色)和红细胞层(红色)，用毛细吸管轻轻吸収淋巴细胞层，置于另一 10~15iti1离心 管中6) 用PBS或牛•理盐水作等量稀释， 1 000 r/min离心lOinin7) 小心弃上清，按步骤(6)用PBS或生理盐水洗两次8) 用PBS或生理盐水按每lOnd血悬lml的比例重悬沉淀,分装入Eppendorf管中,离心后 将沉淀保存于-70°C或置于冰浴中以供RNA提取备用3杂交瘤细胞的制备(1) 杂交瘤细胞T25方瓶中长成单层后，将杂交瘤细胞轻轻吹下，置入15ml试管中2) 在低速离心机上 1 000 r/min离心lOmin,用PBS或生理盐水洗涤两次3) 用PBS 4ml或生理盐水重悬细胞沉淀于4个Eppendorf管中离心弃上清，将沉淀物保 存于-70°C或置于冰浴中以供RNA提取备用二) 总细胞RNA的提取在建库过程中，山于cDNA合成这一步将使用通用引物oligo dT,因此在总RNA提取这一步中，提取纯化mRNA不是非常必要的提取高纯度的 总细胞RNA足可以被用作cDNA合成的模板，目丽提収RNA的方法很多，也有不少商业化的试 剂盒,这里介绍两家公司的RNA提取试剂盒及其方法。

1 TRIZOL 法(1) 在上述方法中制备的带有细胞沉淀的Eppendorf管中加入lml TRIZOL溶液，用手反复摇 匀至细胞碎块完全被裂解，如不易完全裂解，可用移液器带冇lml无菌吸头反复吹打、研磨, 至组织细胞完全裂解，液体基木澄清为止，必要情况下，可再次加入少许TRTZOL 溶液2) 将上述Eppendorf管置室温(25、27°C)静置15~20min后(也可置4°C较长时间)，每管加 入02ml氯仿(0 2ml/ml),在手中反复振荡摇匀，室温静置10mino(3) 将Eppendorf管置丁•高速台式冷冻离心机，或将普通离心机事先置4°C冰箱预冷在4°C12 000 r/min 离心 10mino(4) 小心吸取上层水相置于另一无菌的新的Eppendorf管中，内含有提取的细胞总RNA5) 于管中加入0 5ml界丙醇，室温沉淀lOmin或4°C沉淀30min至lh6) 4°C 12 000 r/min离心lOmin,弃上清，沉淀用75%无水乙醇洗两次7) 最后让沉淀的RNA在室温自然T燥，切勿抽T⑻每悖用旷10卩1无RXAase的纯水重悬干燥后的RNA,置于冰浴立即用于cDNA合成或置 -70°C长期保存。

2 标准 RNA 分离试剂盒(standard RNA isolation Kit)法(1) 在变性的异硫氢酸M(guanidinium isothiocyonate)溶液中(溶液D)加入0 1ml二疏 基乙醇最终至14ml变性溶液2) 加入lml溶液D至Eppendorf管中沉淀细胞(约10 7细胞),悬起沉淀，使细胞碎片裂解3) 加入0 lml 2mol/L pH值4 0醋酸钠,混匀,分成两小管⑷每管中加入0 5ml水饱和酚，充分混匀⑸每管加入lml氯仿 界戊醇溶液，混匀10s置冰浴15min,如果未形成两层，另加入0 5~ln】l氯仿 异戊醇溶液⑹置 4°C, 12 000 r/min 离心至少 20mino(7) 将上层水相转移至一•新鲜Eppendorf管中，加等量界丙醇，置-20°C沉淀lh8) 12 000 r/min 4°C离心 20min,沉淀 RNA9) 重悬RNA沉淀于0 5ml溶液D中10) 加0 5ml异丙醇混合摇匀，存放-20°C备用11) 临用前 12 000 r/min 4°C离心沉淀，用75%乙醇洗一次12) 室温自然干燥沉淀的RNA,切勿过于干燥13) 重悬于50 u 1无RNA酶的纯水中。

仃4)检测RNA纯度和浓度：260/280nm吸收浓度比值需1 8如果比值过低，表明有蛋白质或 酚污染RNA浓度(P g/ml)=260nm吸收值X稀释度X 40一般免疫后的鼠脾脏，可获总S 30^50 ugRNA,人外围血则少些，RNA总量约为20^30 u g/50ml外周血三) cDNA的合成如常规方法，合成cDNA的试剂盒很多，这里推荐使用GIBCO BRL 的第一链合成试剂(Super Script Preapl i fication System for First SynthesisCat NO 18089 011)1将上述从淋巴细胞或杂交瘤细胞中提取RNA 5~10 u g,约44 u 1总呆置于一个无RNAase 的Eppendorf 管中2 加入 4 U 1(0 5ug/u 1) oligo dT 12~18 ，分成两个管3 每管置于70°C lOmino然后置冰浴至少lmino4 制备以下混合液体10 XPCR缓冲液8 u 1MgCl 2 (25mmol/L)8 y 1 []dNTP 混合液(10mmol/L)4 u 1 []DTT (100mmol/L)8 u 15 加14m1上述反应混合液到每个RNA引物混合管小，轻轻混合，短愆离心。

6 将步骤5混合物置室温5mino7 每管加入 2 U 1 (200U) R转录酶 Super script II RT,置 42°C 60mino8 置70°C 15min终止反应，置冰浴中9 瞬吋离心，加2u 1 RNAase H于每个反应管，37°C 20niino10置于冰浴中或存放-20 C保存四) PCR扩增Fab抗体基因1引物扩增人或鼠Fab抗体基因的引物可根据免疫球蛋白基因不同家族的可变区基因序列设计而成来源于美国Scripps研究所设计的引物，主要用于扩增人源抗体IgGl重链Fd 部分VH和CH1；轻链入链及k链的全长基因，在pCom3b系统表达Fab抗体片段2 PCR扩增Fd及轻链基因PCR扩增方法基本如常规方法，推荐使川美国Promega公司和Perkin Elmergs公司的PCR扩增试剂盒1)在250u 1薄壁PCR反应Eppendorf管中加入:cDNA[]2 u 1[]5’ 端引物(60pm) 1 Li 13Z 端引物(60pm) [] 1 ul口去离子水71 U1置94°C r5min后，立即置于冰上，瞬时离心，在管中加入: cDNA[]2 口1[]10 XPCR 缓冲液 10 u 1MgCl 2 (25mmol/L) []6 u 1[]dNTPs(10mmol/L)8 u 1Taq 酶(5U/ul)[]0 5~1 U 1瞬时离心示，加入广2滴液体石蜡。

2）反应条件：P E 480 PCR 仪，便用以下条件：94°C, lmin;52°C, lmin;72°C, 2minoP E 9600 PCR 仪,使用以下条件:94°C, 15s;52°C,50s;72°C, 15s35个循环，72°C延伸lOmin,置于4°C⑶ 每个反应管中各取5 u 1 PCR反应物，加入适量TAE缓冲液（配方见《分了克隆》）及DNA 凝胶电泳加样缓冲液，在0 8%~1%琼脂糖凝胶中电泳如果PCR反应良好，可见一条660bp左右的条带,为Fd （VH+CH1）或轻链（VL+CL） °（五） PCR产物的纯化这里主要推荐Costar公司生产的Spin X柱子纯化，此方法简单，克隆效率较高，但纯度相対较差①在0 8%〜1%琼脂糖凝胶中，将660bp左右的PCR产物条带切下；②放入Spin X柱子中，置-20°C冻融一次，6 000 r/min离心 20mi n；③于管中加入100 U 1 TE,再次 6 000 r/min离心20min；④加入1/10体积的3mol/L 醋酸钠，再加入2 5借无水乙醇，-70°C沉淀30min或-20°C沉淀至少lh另一种方法为便用QTAGEN公司的PCR纯化试剂盒（略）o（六） Fd和轻链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立1 噬菌体载体pComb3 DXA的制备将pComb3载体DNA转化XLI Blu感受态菌，挑取单个 菌落接种入30~40nd SB A+培养液（30g蛋白豚、20g酵母粉、lOgMOPS,加水至 1 000 ml, pH值7 0,含有100ug/ml氨节青霉素），次日转种500ml SB A+培养过夜，用常规方法或商业化DNA提取试剂盒提取质粒DNA,最后制成5ng/ul浓度左右的质粒DNA。

2 载体DNA和纯化PCR产物的酶切首先将所有不同的重链PCR产物，k链PCR产物，以及 X链PCR产物分别按各自组群混合建库时，可以分別建立重链+k链库或重链+入链库，也可将K链和入链混合，建立重链卜K+入链库，町根据各自的需要选。