2-2电泳技术.ppt

电泳技术Electrophoresis负极正极电泳现象 带电粒子在电场中的定向移动Arne W. K. Tiselius (1902-1971)Tiselius电泳仪电泳技术 利用电泳现象进行分离分析的技术蛋白质的两性电离生物大分子的电荷来源核酸的两性电离n核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性n核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸生物大分子的电荷来源n样品性质影响电泳的主要因素ü分子大小ü所带净电荷量n样品性质影响电泳的主要因素n样品性质n电场强度ü电场强度是单位长度上的电势梯度ü电场强度与带电颗粒移动速度成正比ü电压的热效应影响电泳的主要因素n样品性质n电场强度影响电泳的主要因素n样品性质n电场强度n溶液性质ü溶液的pH值ü溶液的离子强度影响电泳的主要因素n样品性质n溶液性质n电场强度n支持介质ü材质均匀ü对样品吸附力小ü电渗现象影响电泳的主要因素+_Power电渗现象应用——毛细管电泳n样品的电荷效应 带电多，迁移快琼脂糖凝胶电泳n凝胶的筛选效应 分子量小，阻力小，迁移快n主要用于分离鉴定核酸凝胶电泳凝胶色谱琼脂糖凝胶电泳分离DNAn凝胶制备n上样n电泳n染色n结果观察琼脂糖凝胶电泳分离DNA1. 凝胶制备凝胶浓度（％）分辨ＤＮＡ范围　（ｂｐ）０.３５０００～６０００００.６１０００～２０００００.９５００～７０００１.２４００～６０００１.５２００～３０００２１００～２０００琼脂糖凝胶电泳分离DNA加热后加热前1. 凝胶制备琼脂糖凝胶电泳分离DNA2. 上样琼脂糖凝胶电泳分离DNA3. 电泳琼脂糖凝胶电泳分离DNA4. DNA染色溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳分离DNA5. 结果观察（二）（二）DNA的迁移速率决定因素的迁移速率决定因素 1 DNA1 DNA分子的大小分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 2 琼脂糖浓度琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快；  3 DNA3 DNA的构象的构象 超螺旋环状＞线状＞切口环状。

4 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加 5 5 所用的电压所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比 6 6 琼脂糖种类琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖； 不同类型琼脂糖的性质不同类型琼脂糖的性质 琼脂糖类型琼脂糖类型凝结温度凝结温度/℃熔化温度熔化温度/ ℃ 标准琼脂糖标准琼脂糖35~3890~95不同厂不同厂家生产家生产的不同的不同商品其商品其凝结温凝结温度和熔度和熔化温度化温度有一定有一定差异差异40~4285~90 高强度琼脂糖高强度琼脂糖34~4385~95 修饰的低熔点修饰的低熔点/ 凝点琼脂糖凝点琼脂糖25~3563~653565 超低熔点超低熔点8~1540~45 低黏性低熔点琼低黏性低熔点琼脂糖脂糖25~307038853075不同类型琼脂糖分离不同类型琼脂糖分离DNADNA片段的范围片段的范围浓浓 度度（（%））标标 准准(kb)高强度高强度(kb)低熔点低熔点(kb)低黏度低低黏度低溶点溶点(kb)0.31~500.50.7~250.80.5~150.8~100.8~101.00.25~120.4~80.4~81.20.15~60.3~70.3~71.50.08~40.2~40.2~42.00.1~30.1~33.00.05~10.5~14.00.1~0.56.00.01~0.1 7 7 电泳缓冲液电泳缓冲液 常用的有常用的有TAETAE、、TPETPE及及TBETBETAE、、TPE及及TBE电泳缓冲液比较电泳缓冲液比较 都是常用电泳缓冲液。

三者相比：1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE （二） 凝胶载样缓冲液载样缓冲液有三个作用：1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移6×凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液类型类型6 ×缓冲液缓冲液贮存温度贮存温度I0.25%溴酚蓝溴酚蓝4℃0.25%二甲苯氰二甲苯氰FF40% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝溴酚蓝室温室温0.25%二甲苯氰二甲苯氰FF15% Ficoll(Type400)水溶液水溶液III0.25%溴酚蓝溴酚蓝4℃0.25%溴酚蓝溴酚蓝%二甲苯氰二甲苯氰FF30%甘油水溶液甘油水溶液IV0.254℃40% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液（三）琼脂糖凝胶中（三）琼脂糖凝胶中DNADNA的检测的检测 通过染色通过染色, , 紫外灯下检测。

紫外灯下检测 主要有溴化乙锭（主要有溴化乙锭（ethidiumethidium bromide, bromide, EBEB）染色法和）染色法和SYBR GoldSYBR Gold染色法1 1 凝胶的凝胶的EBEB染色染色使用使用EB染色注意事项染色注意事项（（1 1））EBEB被认为是一种被认为是一种强致癌物质强致癌物质（（2 2））EBEB可用来检测单链或双链核酸可用来检测单链或双链核酸 （3）EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml （4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色2 2 凝胶凝胶SYBR GoldSYBR Gold的染色的染色 SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号（四）（四） 凝胶中凝胶中DNADNA的成像的成像 可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察（五） 凝胶中DNA的回收现一般采用试剂盒回收：现一般采用试剂盒回收： 存在的主要问题：存在的主要问题：1 1 不能有效的回收大片段不能有效的回收大片段DNA DNA 2 2 不能有效回收少量不能有效回收少量DNADNA n样品的电荷效应和凝胶的筛选效应是分离的主要依据n凝胶是由丙烯酰胺聚合而成n主要用于蛋白质的分离分析聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。

在双功能交联剂如N，N`-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度一）（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质聚丙烯酰胺凝胶的本质CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N`-亚甲双丙烯酰胺） （二）（二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响 用途：制备高纯度的DNA片段（三）（三）DNADNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度（（%））有效分离范围有效分离范围（（bp））二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚蓝溴酚蓝3.51000~20004601005.080~500260658.060~4001604512.040~200702015.025~150601520.06~1004512注注:N,N`-:N,N`-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/301/30; ; 蛋白质样品处理加热联合SDS可消除蛋白质的结构差异及电荷差异，使其电泳迁移完全取决于相对分子量十二烷基硫酸钠（SDS）PAGE电泳装置PAGE的结果观察考马斯蓝染色凝胶成像仪扫描生物大分子的分离鉴定n核酸序列测定及比较n蛋白质的相对分子量测定电泳技术的生物学应用 药物分析 n药物的组分分析、成分提取n药物-蛋白质相互作用研究n兴奋剂检测电泳技术的生物学应用临床检验 n血清蛋白电泳 了解患者血清蛋白质全貌，可作初筛实验n血红蛋白及糖化血红蛋白电泳 指导贫血病分型诊断与治疗n尿蛋白电泳 辅助判断肾脏的病变程度n脑脊液蛋白电泳 脊髓炎等疾病的诊断电泳技术的生物学应用 其他应用 n亲子鉴定n身份鉴别电泳技术的生物学应用n基本介绍 利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术n工作原理 样品的电荷效应 凝胶的筛选效应n常用方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳n生物学应用 生物物质分离纯化的常用手段之一电泳技术小结实验安全。