医学分子生物学课件：Western Blot原理与方法.ppt

Western Blot原理与方法原理与方法 Diagram通过通过电泳电泳区分不同的组区分不同的组分，并分，并转移转移至固相支持至固相支持物，通过特异性试剂物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对（抗体）作为探针，对靶物质进行靶物质进行检测检测蛋白质的质的Western BlotWestern Blot技术技术结合了凝胶电泳的高分结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，特异敏感等多种特点，可检测到低至可检测到低至1 1～～5ng5ng中中等大小的靶蛋白等大小的靶蛋白 原理原理Western Blot原理原理二抗孵育二抗孵育蛋白提取与定量蛋白提取与定量一一抗孵育抗孵育封闭封闭转膜转膜SDS-聚丙烯酰胺电泳聚丙烯酰胺电泳蛋白变性蛋白变性显影显影vSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）） 蛋白样品经蛋白样品经SDSSDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快 v电转移电转移    将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上。

将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上 v酶免疫定位酶免疫定位 将转印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶将转印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色使区带染色 广广泛泛用用于于蛋蛋白白质质样样品品分分析析研研究究一、一、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳－聚丙烯酰胺凝胶电泳（一）（一） SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理v溶液中的带电颗粒在电场作用下的移动大致受到溶液中的带电颗粒在电场作用下的移动大致受到三方面影响：三方面影响：Ø颗粒性质：体积大小及形状、实际电荷数、解离颗粒性质：体积大小及形状、实际电荷数、解离强度等Ø环境：电解质或缓冲液的浓度、离子强度、环境：电解质或缓冲液的浓度、离子强度、pHpH值、值、温度等Ø应用电场：电场强度应用电场：电场强度 蛋白变性蛋白变性Tris-Cl(pH 6.8) Tris-Cl(pH 6.8) SDS SDS 甘油甘油 溴酚蓝溴酚蓝β-β-巯基乙醇巯基乙醇 高温变性高温变性, ,形成形成SDS-蛋蛋白质复合物白质复合物加入Sample buffer沸水浴5min（一）（一）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理vSDS （（十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠））是是一一种种阴阴离离子子表表面面活活性性剂剂。

加加入入蛋蛋白白质质样样品品中中，，它它可可以以断断开开分分子子内内和和分分子子间间的的氢氢键键，，破破坏坏蛋蛋白白质质分分子子的的二二级级及及三三级级结结构构，，并并与与蛋蛋白白质质的的疏疏水水部分相结合，部分相结合，v强强还还原原剂剂（（巯巯基基乙乙醇醇））可可以以断断开开蛋蛋白白质质分分子子内内的的二二硫硫键键破破坏坏蛋蛋白白质质分分子子四四级级结结构构，，使使蛋蛋白白质质分分子子被被解解聚聚成成肽肽链链形形成成单单链链分分子子解解聚聚后后的的侧侧链链与与SDS充充分分结结合合形形成成带带负负电的电的SDS-蛋白质复合物蛋白质复合物vSDS-蛋蛋白白质质复复合合物物上上带带有有大大量量的的负负电电荷荷，，平平均均每每两两个个氨氨基基酸酸残残基基结结合合一一个个SDS分分子子，，其其所所带带负负电电荷荷的的量量远远远远超超过过它它原原有有的的净净电电荷荷，，从从而而消消除除了了不不同同分分子子之之间间原原有有净净电电荷荷的的差差异异因因此此，，经经SDS处处理理的的蛋蛋白白电电泳泳时时，，与与电电荷荷和形状无关，只与蛋白质样品的分子量有关和形状无关，只与蛋白质样品的分子量有关一）（一）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理（一）（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理产物：三维网状结构凝胶产物：三维网状结构凝胶加速剂加速剂催化剂催化剂单体单体交联剂交联剂缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液Tris-ClTris-Cl四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMED））丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr））过硫酸胺（过硫酸胺（AP））亚甲双丙烯酰胺（亚甲双丙烯酰胺（Bis））丙丙烯烯酰酰胺胺（（Acr））单单体体，，在在催催化化剂剂过过硫硫酸酸胺胺（（AP））和和加加速速剂剂TEMED的的存存在在下下，，丙丙烯烯酰酰胺胺产产生生聚聚合合反反应应，，形形成成长长链链，，加加入入交交联联剂剂甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺（（Bis）），，形形成成三三维维网网状状结结构构的的凝胶。

凝胶凝凝胶胶的的网网孔孔大大小小取取决决于于聚聚合合链链的的长长度度及及交交叉叉连连接接的的程程度度聚聚合合链链的的长长度度决决定定于于聚聚合合反反应应中中的的单单体体丙丙烯烯酰酰胺胺浓浓度度而而凝凝胶胶中中网网孔孔的的大大小小则则由由Acr与与Bis的的相相对对比比例例决决定定，，调调节节单单体体与与交交连连剂剂的的浓浓度度比比例例，，可可形形成成不不同同网网孔孔大大小小的的凝凝胶胶，，适适用用于不同大小物质的分离于不同大小物质的分离聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶常常规规灌灌制制于于两两块块封封闭闭的的平平板板之之间间，，然然后后进进入入垂直电泳垂直电泳一）（一）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理vSDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳的的分分辨辨率率高高是是因因为为其其分分离离效效应除了电荷效应、分子筛效应外，还具有浓缩效应应除了电荷效应、分子筛效应外，还具有浓缩效应v为为了了达达到到这这种种效效应应，，SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳大大多多采采用用不不连连续续电电泳泳，，所所谓谓不不连连续续电电泳泳，，指指使使用用不不同同孔孔径径和和不不同同缓缓冲冲系系统统的的电电泳泳。

其其浓浓缩缩胶胶的的孔孔径径、、缓缓冲冲液液的的pH值值和和离离子子强强度度不不同同于于分分离离胶胶的的不不连连续续电电泳泳的的分分辨辨率率大大高于连续电泳大大高于连续电泳v并并且且电电泳泳槽槽缓缓冲冲液液的的pH值值与与离离子子强强度度不不同同于于配配胶胶缓缓冲冲液液当当两两电电极极间间接接通通电电流流后后，，凝凝胶胶中中形形成成移移动动界界面面，，并带动样品中所含的并带动样品中所含的SDS-蛋白质复合物向前推进蛋白质复合物向前推进 （一）（一）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理（一）（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 作用缓冲液pH凝胶浓度浓缩胶浓缩胶使蛋白样品浓缩使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-ClpH6.8Tris-Cl 低，低，2-5%2-5%分离胶分离胶使蛋白样品分离使蛋白样品分离pH8.8Tris-ClpH8.8Tris-Cl 高，根据蛋白高，根据蛋白大小大小电泳缓冲液：电泳缓冲液：pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸甘氨酸-SDS-SDS系统系统浓缩胶的作用原理浓缩胶的作用原理 v样品和浓缩胶均用样品和浓缩胶均用 pH 6.8的的 Tris-HCI缓冲液，电泳缓冲液缓冲液，电泳缓冲液选用选用pH8.3的的Tris-甘氨酸缓冲液。

此时，甘氨酸很少解离，甘氨酸缓冲液此时，甘氨酸很少解离，有效泳动率很低，氯离子却有很高的泳动率，蛋白质分子的有效泳动率很低，氯离子却有很高的泳动率，蛋白质分子的泳动率介于其间泳动率介于其间v一旦加上电压，作为先导离子的氯离子和作为尾随离子的甘一旦加上电压，作为先导离子的氯离子和作为尾随离子的甘氨酸离子分离开来，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白氨酸离子分离开来，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动由于导电性与电场强度成反比，分子就介于二者之间泳动由于导电性与电场强度成反比，这一区带便获得较高的电压梯度，加速甘氨酸的泳动，使其这一区带便获得较高的电压梯度，加速甘氨酸的泳动，使其赶上氯离子因此，甘氨酸、氯离子所形成的赶上氯离子因此，甘氨酸、氯离子所形成的移动界面移动界面压着压着蛋白质分子堆积到一起，浓缩为一狭窄的区带蛋白质分子堆积到一起，浓缩为一狭窄的区带v由于浓缩胶为大孔凝胶，故对样品没有分子筛作用由于浓缩胶为大孔凝胶，故对样品没有分子筛作用一）（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理（一）（一）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理v当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时，凝胶当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时，凝胶的的pH值明显增加，并导致甘氨酸的大量解离。

此时值明显增加，并导致甘氨酸的大量解离此时甘氨酸的有效泳动率增加，使它越过蛋白质并直接甘氨酸的有效泳动率增加，使它越过蛋白质并直接在氯离子后移动在氯离子后移动v同时由于凝胶孔径变小，使蛋白质分子的迁移率减同时由于凝胶孔径变小，使蛋白质分子的迁移率减小于是蛋白质分子在均一的电压梯度和小于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH值中泳值中泳动，并根据其固有的带电性和分子大小进行分离动，并根据其固有的带电性和分子大小进行分离 （一）（一）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度一）（一）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理蛋白质大小与凝胶浓度蛋白质大小与凝胶浓度5％57~212kd7.5%36~94kd10%16~68kd12.5%15~60kd15%15~45kd20%2~15kd（一）（一）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理SDS-聚丙烯酰胺分离胶配方聚丙烯酰胺分离胶配方（一）（一）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方（一）（一）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理（（1 1）试剂材料）试剂材料 1 1、、3030％％凝凝胶胶贮贮备备液液：：含含2929％％（（W/VW/V））丙丙烯烯酰酰胺胺和和1 1％％（（W/VW/V））甲甲叉双丙烯酰胺，用去离子水配制，避光贮存于棕色瓶中。

叉双丙烯酰胺，用去离子水配制，避光贮存于棕色瓶中2 2、、1010％％SDSSDS，去离子水配制，贮存于室温中，去离子水配制，贮存于室温中3 3、、TEMEDTEMED4 4、、1010％过硫酸胺：用无离子水配制少量，最多％过硫酸胺：用无离子水配制少量，最多4℃4℃贮存一周；贮存一周；5 5、、浓浓缩缩胶胶电电泳泳缓缓冲冲液液 Tris-HClTris-HCl（（pH6.8pH6.8））分分离离胶胶电电泳泳缓缓冲冲液液Tris-HClTris-HCl（（pH8.8 pH8.8 ）） （二）（二）SDS- 聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳方法步泳方法步骤6 6、电泳缓冲液：、电泳缓冲液：Tris-Tris-甘氨酸甘氨酸 （（pH8.3pH8.3））7 7、上样缓冲液：、上样缓冲液： 100mmol/L Tris-Cl 100mmol/L Tris-Cl （（pH6.8pH6.8）） 200mmol/L 200mmol/L ββ- -巯基乙醇巯基乙醇 10%SDS10%SDS 0.2% 0.2%溴酚兰溴酚兰 20%20%甘油甘油 8 8、蛋白样品（、蛋白样品（ENAENA）：用）：用pH7.4 0.01M PBSpH7.4 0.01M PBS从牛胸腺从牛胸腺 丙酮粉中抽提，浓度为丙酮粉中抽提，浓度为5mg/ml5mg/ml，，-70℃-70℃保存备用。

保存备用9 9、垂直电泳槽、电泳仪、稳压器、微量加样器、滴、垂直电泳槽、电泳仪、稳压器、微量加样器、滴 头、头、EPEP管、吸管等管、吸管等1010、考马斯亮蓝染液、丽春红染液考马斯亮蓝染液、丽春红染液 （二）（二）SDS- 聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳方法步泳方法步骤（（2 2）操作）操作1 1、玻璃板准备：依次用水、、玻璃板准备：依次用水、1010％％SDSSDS、、H H2 2O O、乙醇和、乙醇和 水冲洗，干燥水冲洗，干燥2 2、配制分离胶：总量、配制分离胶：总量5ml5ml，其中：，其中： 水水 1.6ml1.6ml 3030％丙烯酰胺溶液％丙烯酰胺溶液 2.0ml2.0ml 1.5mol/L Tris-HCl1.5mol/L Tris-HCl（（pH8.8pH8.8）） 1.3ml1.3ml 1010％％SDS 0.05mlSDS 0.05ml 1010％过硫酸铵％过硫酸铵 0.05ml0.05ml TEMED 0.002mlTEMED 0.002ml （二）（二）SDS- 聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳方法步泳方法步骤灌制分离胶 隔绝空气灌好后一般室温放置灌好后一般室温放置30－－40分钟分钟 （二）（二）SDS- 聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳方法步泳方法步骤3 3、配制浓缩胶：总量、配制浓缩胶：总量2ml2ml，其中：，其中： 水水 1.4ml1.4ml 3030％丙烯酰胺溶液％丙烯酰胺溶液 0.33ml0.33ml 1.0mol/L Tris-HCl1.0mol/L Tris-HCl（（pH6.8)pH6.8)）） 0.25ml0.25ml 1010％％SDS 0.02mlSDS 0.02ml 1010％过硫酸铵％过硫酸铵 0.02ml0.02ml TEMED 0.002mlTEMED 0.002ml 将配制好的浓缩胶注入分离胶上端，插入梳子，将配制好的浓缩胶注入分离胶上端，插入梳子， 应小心避免气泡。

应小心避免气泡  （二）（二）SDS- 聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳方法步泳方法步骤（一）（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳灌制积层胶灌制积层胶                      插入梳子插入梳子 （二）（二）SDS- 聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳方法步泳方法步骤 4 4、加样：将蛋白样品（、加样：将蛋白样品（ENAENA）与上样缓冲液等体积混）与上样缓冲液等体积混合，煮沸合，煮沸3--5min3--5min后，将其加入梳孔内（根据自己的设计后，将其加入梳孔内（根据自己的设计上样），每孔上样），每孔2020 l l也可根据自己的设计上样也可根据自己的设计上样 5 5、电泳：开始时、电泳：开始时80V80V恒压跑浓缩胶，当溴酚蓝压缩恒压跑浓缩胶，当溴酚蓝压缩成一条线并进入分离胶后把电压调为成一条线并进入分离胶后把电压调为100V100V，继续电泳直，继续电泳直到溴酚蓝跑至离胶的下面还有到溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.40.4－－0.6mm0.6mm时停止电泳时停止电泳 6 6、染色：取下凝胶，切下一部分用考马斯亮蓝染液、染色：取下凝胶，切下一部分用考马斯亮蓝染液染色，其余用于电转移。

染色，其余用于电转移 （（3））SDS-PAGE胶制备注意事项胶制备注意事项v过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4℃4℃放置放置2 2－－3 3天配制3030％丙烯酰胺储存液要过滤％丙烯酰胺储存液要过滤v配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况出现浓度不均的情况v要根据温度调整要根据温度调整TEMEDTEMED的使用量的使用量v水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平v插梳子的时候要用力均匀，一次成型插梳子的时候要用力均匀，一次成型二）（二）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳方法步骤－聚丙烯酰胺凝胶电泳方法步骤二、电转移二、电转移    （一）电转移原理（一）电转移原理    蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上（二）（二） 电转移方法步骤电转移方法步骤（（1 1）材料）材料 转移缓冲液、转移电泳槽、电泳仪、稳压器、转移缓冲液、转移电泳槽、电泳仪、稳压器、NCNC膜、膜、Whatman3MMWhatman3MM滤纸、海绵等滤纸、海绵等（（2 2）方法）方法 1 1、、剪剪6 6块块滤滤纸纸和和一一块块NCNC膜膜，，其其大大小小应应与与SDSSDS凝凝胶胶的的大大小小相相同同。

如如果果纸纸或或膜膜比比凝凝胶胶大大，，在转移过程中会形成短路在转移过程中会形成短路2 2、、将将剪剪好好的的3MM3MM滤滤纸纸及及NCNC膜膜在在转转移移缓缓冲冲液液中浸泡中浸泡3~53~5分钟  3 3、按下列过程安装转移装置：、按下列过程安装转移装置： （（1 1））将将塑塑料料支支架架平平放放在在含含有有转转移移缓缓冲冲液的托盘中，在塑料支架上放一块海绵液的托盘中，在塑料支架上放一块海绵 （（2 2））将将3 3块块3MM3MM滤滤纸纸对对齐齐放放在在海海绵绵上上，，依依次次放放置置NCNC膜膜、、凝凝胶胶、、另另外外3 3块块3MM3MM滤滤纸纸及及海海绵绵在在放放置置每每一一层层时时，，均均要要去去除除它它们们之之间间的的气气泡泡，，若若有有气气泡泡残残留留，，则则影影响响转移效果转移效果 （（3 3））最最后后用用塑塑料料支支架架夹夹紧紧上上述述各各层层，，放放入入电电转转移移槽槽内内，， 注注意意NCNC膜膜一一侧侧靠靠正正极极，，胶一侧靠负极胶一侧靠负极 4 4、、接接通通电电源源，，电电压压40V40V，，电电流流0.17-0.2A0.17-0.2A，，转转移移1.5-61.5-6小小时时，，转转移移时时间间可可根根据据靶靶蛋蛋白白的的大大小小来来定定，，蛋蛋白白质质分分子子量小则需时短，蛋白质分子量大需时长。

量小则需时短，蛋白质分子量大需时长 5 5、、转转移移结结束束后后，，取取出出塑塑料料支支架架，，依依次次去去掉掉各各层层，，取取下下NCNC膜膜放放一一张张干干净净滤滤纸纸上上室室温温下下晾晾干干，，切切下下一一小小部部分分NCNC膜，丽春红染色观察转印情况膜，丽春红染色观察转印情况6 6、、余余下下的的NCNC膜膜用用1 1％％的的牛牛血血清清白白蛋蛋白白（（BSABSA））4℃4℃过过夜夜封闭（（3）转膜注意事项：）转膜注意事项：vPVDFPVDF膜要预先用甲醇活化；膜要预先用甲醇活化；NCNC膜要预先泡水，除去中间的气泡然后膜要预先泡水，除去中间的气泡然后在转膜也中平衡在转膜也中平衡2020分钟v膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地方膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地方就会断路，蛋白无法转到膜上就会断路，蛋白无法转到膜上v转膜要在冰浴中进行，防止散热量太大导致转膜温度过高转膜要在冰浴中进行，防止散热量太大导致转膜温度过高v根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件分子量（分子量（kd））转膜条件转膜条件<20200mA恒流恒流1小时小时20-100200mA恒流恒流2小时小时100-200200mA恒流恒流6小时或小时或30V恒压过夜恒压过夜>200同上，可在转膜液中加同上，可在转膜液中加0.1％％SDS（二）电转移（二）电转移（（4）膜的封闭）膜的封闭        为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理，一般用合位点进行封闭处理，一般用5 5％的脱脂奶粉或者％的脱脂奶粉或者1 1％的％的BSABSA室温或室温或37℃37℃封闭封闭2 2小时。

小时ProteinProtein三、酶免疫定位三、酶免疫定位转好膜的蛋白转好膜的蛋白（一）固相酶免疫测定原理（一）固相酶免疫测定原理ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking Agent封闭封闭（一）酶免疫定位原理（一）酶免疫定位原理ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary Antibody（三）固相酶免疫测定（三）固相酶免疫测定一抗孵育一抗孵育（一）酶免疫定位原理（一）酶免疫定位原理ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentE EE EPrimary AntibodySecondary Antibody二抗孵育二抗孵育（一）酶免疫定位原理（一）酶免疫定位原理ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentE EE EPrimary AntibodySecondaryAntibody－Enzyme (E)sssssPPPP Substrate显色显色（一）酶免疫定位原理（一）酶免疫定位原理较常用的显色方法有：较常用的显色方法有：v固相酶免疫定位显色法固相酶免疫定位显色法 辣根过氧化物酶作用于辣根过氧化物酶作用于DABDAB底物直接显色底物直接显色——褐色褐色 v酶免疫化学发光显色法酶免疫化学发光显色法  是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质, ,生成生成一种不稳定的中间物质一种不稳定的中间物质, ,其衰变时在暗室内形成其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带明显的肉眼可见的化学发光带, ,利用利用X X线胶片感线胶片感光原理，将结果记录下来。

光原理，将结果记录下来  （一）酶免疫定位原理（一）酶免疫定位原理科学的对照科学的对照v蛋白蛋白MarkerMarker：预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小：预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪和示踪v阳性对照：目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于阳性对照：目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性检验整个实验体系和过程的正确性有效性/ /特别是一抗的质量和效率特别是一抗的质量和效率v阴性对照：非目的蛋白或明确不表达目的蛋白组织或细胞的蛋白提取物，用阴性对照：非目的蛋白或明确不表达目的蛋白组织或细胞的蛋白提取物，用于检验抗体的特异性于检验抗体的特异性v二抗对照：不加一抗，用于检验二抗的特异性二抗对照：不加一抗，用于检验二抗的特异性v内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个测整个WBWB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照的标准对照v空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果（一）酶免疫定位原理（一）酶免疫定位原理蛋白蛋白Marker（一）酶免疫定位原理（一）酶免疫定位原理（二）（二）酶酶免疫定位方法步免疫定位方法步骤（（1 1）材料）材料 1 1、洗涤液：含、洗涤液：含0.050.05％吐温％吐温-20-20的的pH7.4pH7.4的的PBSPBS 2 2、酶标抗人、酶标抗人IgGIgG 3 3、阴性对照血清、阳性对照血清、阴性对照血清、阳性对照血清 4 4、底物溶液、底物溶液 5 5、终止液、终止液 6 6、恒温摇床、微量加样器、反应槽、塑料袋、、恒温摇床、微量加样器、反应槽、塑料袋、 滴管、吸管等。

滴管、吸管等  （（2 2）方法）方法 1 1．次日取出已封闭的．次日取出已封闭的NCNC膜，用洗涤液漂洗膜，用洗涤液漂洗5 5次，每次次，每次 1min1min 2. 2. 将剪下条带放入反应槽中，加入将剪下条带放入反应槽中，加入1ml1ml洗涤液，再洗涤液，再 已加入已加入20μl20μl血清混匀，血清混匀，37℃37℃恒温摇动恒温摇动40min40min 3 3．取出洗涤液漂洗．取出洗涤液漂洗5 5次，每次次，每次1min1min 4 4．加入．加入1ml1ml酶标羊抗人酶标羊抗人IgGIgG，，37℃37℃恒温摇动恒温摇动30min30min 5 5．取出洗涤液漂洗．取出洗涤液漂洗5 5次，每次次，每次1min1min 6 6．加入底物液．加入底物液1ml1ml，显色，显色10min10min 7 7．加入终止液终止反应．加入终止液终止反应 。