可食性动物组织中卡巴氧残留标示物ELISA检测方法的建立.docx

    可食性动物组织中卡巴氧残留标示物ELISA检测方法的建立    张泽英+袁宗辉Summary：将卡巴氧残留标示物喹喔啉-2-羧酸（QCA）与γ-氨基丁酸（ABA）衍生成喹喔啉-2-甲酰胺丁酸（QCA-ABA），再与牛血清白蛋白（BSA）偶联作为免疫原（QCA-ABA-BSA），将QCA与卵清白蛋白（OVA） 偶联作为包被原（QCA-OVA），建立了猪可食性组织中QCA的间接竞争ELISA检测方法结果表明，最优的QCA-OVA包被抗原浓度为4 μg/mL，抗体稀释倍数为1∶3.2×104，最适检测范围为0.2～51.2 ng/mL，最低检测限为0.6 μg/kg，对猪肌肉和猪肝脏的添加回收率为47.4%～87.7%Keys：卡巴氧；喹喔啉-2-羧酸；ELISA；残留检测TS251.7 ：A ：0439-8114（2014）01-0193-04Development of an ELISA Method for Screening of Marker Residue of Carbadox in Animal Edible TissuesZHANG Ze-ying1，YUAN Zong-hui2（1.Department of Food Engineering， Wuhan Bioengineering Institute， Wuhan 430015， China；2.Ministry of Agriculture Key Laboratory of Food Safety evaluation， Wuhan 430070， China）Abstract： Derivatized quinoxaline-2-carboxylic acids a marker residue of carbadox with γ-amino butyric acid（ABA）， was conjugated to BSA to prepare immunogen（QCA-ABA-BSA）， and QCA was conjugated to OVA to prepare coating antigen（QCA-OVA）. Indirect competitive ELISA for QCA derivatizative （QCA-ABA） was established to determine QCA in pig edible tissues. The results of the experiment demonstrated that the optimal concentration of the coating antigen， dilution multiple of polyclonal antibody against QCA-ABA were 4 μg/mL， 1∶3.2×104， respectively. The standard curve of indirect competitive ELISA is also established. The curve has a favorable linearity relation within the concentration range of 0.2～51.2 ng/mL， indicaing that the lowest detection limit is 0.6 μg/kg， with the recovery rate of 47.4%～87.7% in swine muscle and liver tissues.Key words： carbadox； QCA； ELISA； residue determination收稿日期：2013-09-29基金项目：上海市科技兴农计划项目（沪农科攻字2003B99）作者简介：张泽英（1980-），女，四川泸州人，讲师，硕士，主要从事食品分析检测工作，（）027-89665836（电子信箱）27185096@；通讯作者，袁宗辉，教授，博士生导师，（电子信箱）zonghui55@。

卡巴氧于1999年被欧盟列为禁用药，随后许多国家也出台了相应的法规限制该药的使用然而，由卡巴氧残留引发的食品安全问题仍时有发生目前，大量出口到欧盟等国的可食性动物组织主要是利用色谱方法，如LC-UV[1，2]、GC-MS[3]和LC-MS-MS[4-7]监测卡巴氧及其代谢物的残留，这些技术耗时、耗力，并且需要大量资金，不适合高通量筛选，因此很有必要开发一种快速、低廉的高通量筛选方法来满足卡巴氧残留监测的需求ELISA以免疫结合反应为原理，在简化分析过程、提高速度和降低成本方面具有特殊意义，能弥补上述不足，因而发展迅速该研究以卡巴氧残留标示物喹喔啉-2-羧酸（Quinoxaline-2-carboxylic acid，QCA）为半抗原制备多抗，旨在建立一种可用于可食性动物组织中卡巴氧残留的ELISA 检测方法1 材料与方法1.1 试剂与仪器喹喔啉-2-羧酸（QCA，≥99%，Sigma公司）；牛血清白蛋白（BSA，≥98%，Sigma公司）；卵清白蛋白（OVA，>90%，Sigma公司）；羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶（Sigma公司）；其他试剂均为分析纯96 孔聚苯乙烯酶联反应板（浙江黄岩化学塑料实验厂）；Oasis MAX固相萃取柱（60 mg/3 mL，上海楚柏实验室设备有限公司）；BIORAD Model 550 型酶联免疫检测仪（日本BIORAD公司）；UV751GD 型紫外可见光分光光度计（上海第三分析仪器厂）；R200D型电子分析天平（赛多利斯公司（德国）；HKCB23 型恒温磁力搅拌器（温州市医疗电器厂）。

1.2 试验方法1.2.1 人工抗原和包被原的合成 人工抗原和包被原的合成参照文献[8]1.2.2 免疫程序及抗体的制备 免疫程序及抗体的制备参照文献[8]1.2.3 间接竞争ELISA 基本程序 间接竞争ELISA 基本程序参照文献[9]①以一定浓度的包被原复合物包被96（8×12）孔酶标板，每孔100 μL，4 ℃包被过夜，磷酸盐吐温缓冲液洗涤2次，每次静置2 min，于干净吸水纸上拍干；②以1% BSA溶液封闭，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，磷酸盐吐温缓冲液洗涤3次，拍干；③每列A-G孔加入系列稀释的被检测抗原（或磷酸盐缓冲液）和一定稀释度的抗体的预混液，H孔作为零对照，只加特定稀释度的阴性血清，37 ℃孵育1 h，磷酸盐吐温缓冲液洗涤3次，拍干；④加入稀释度为1∶5 000的羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶标记物，每孔100 μL，37 ℃反应1 h，磷酸盐吐温缓冲液洗涤5次，拍干；⑤加入TMB显色液，每孔100 μL，室温避光显色15～20 min；⑥终止显色反应，每孔加入2 mol/L H2SO4 溶液50 μL，用酶标检测仪测定各孔的OD490值；⑦依据OD490值，以待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的3倍，即判断为阳性。

1.2.4 间接竞争ELISA反应条件的优化 采用方阵滴定法和间接竞争ELISA法确定抗原最佳包被浓度、抗体最佳稀释度、抗体最佳工作量和最佳竞争时间1.2.5 标准曲线的制备 在间接竞争ELISA反应的最佳反应条件下，将QCA用二氯甲烷稀释成0.0、0.2、0.8、3.2、12.8、51.2 ng/mL系列浓度，加入一定量的衍生试剂和催化剂，37 ℃衍生反应，反应完毕后47 ℃下氮气吹干，用磷酸缓冲液（pH 7.4）定容至原始浓度，用间接竞争ELISA测定所获得的标准品吸光值的平均值除以0.0 ng/mL标准的吸光值为抑制率（B/B0），以QCA溶液浓度的对数值（lg[QCA]）为横坐标，以抑制率（B/B0）为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程1.2.6 添加回收率的测定 取2 g组织（猪肉、猪肝）均质物，加入5%偏磷酸和10%甲醇溶液各5 mL，振荡2 min，4 800 r/min离心10 min，取上清液，再按上述步骤重复提取1次，合并两次提取液；在提取液中加入6 mL乙酸乙酯，振荡2 min，4 800 r/min离心10 min，取上清液，重复萃取1次，合并乙酸乙酯层；加入0.5 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）5 mL反萃取，振荡1 min，提取下清液，再按上述步骤重复提取1次，合并水相。

分别用3 mL甲醇和3 mL水活化Oasis MAX固相萃取柱取3 mL样品提取液注入活化后的Oasis MAX固相萃取柱，待样品提取液全部流出后，分别用0.05 mol/L NaOH溶液3 mL、甲醇3 mL淋洗，除去杂质干扰，最后用2%甲酸甲醇溶液3 mL洗脱，收集洗脱液，45 ℃下氮气吹干，加入2 mL二氯甲烷溶解残渣加入一定量的衍生试剂和催化剂37 ℃衍生反应5 h，反应完毕后47 ℃下氮气吹干，向离心管中加入样本稀释液2 mL，振荡30 s，作为试样溶液，供ELISA方法测定2 结果与分析2.1 优化的ELISA反应条件2.1.1 抗原最佳包被浓度 以方阵滴定法中OD值在1.0左右的包被抗原浓度（4 μg/mL）为中心浓度，等差设5个浓度（2、3、4、5、6 μg/mL）作间接竞争ELISA，曲线斜率最大的抗原浓度为最佳包被浓度（图1）结果表明，最佳抗原包被浓度为4 μg/mL2.1.2 抗体最佳稀释度 方阵滴定确定的抗体稀释度（1∶3.2×104）为中心浓度，设计1∶1.6×104、1∶2.4×104、1∶3.2×104、1∶4.8×104、1∶6.4×104 5个浓度作间接竞争ELISA（图2）。

结果表明，抗体稀释度为1∶3.2×104时，曲线斜率最大，抗体反应最灵敏2.1.3 样品与抗体最佳比例 设计5个抗体与药物的工作配比（70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70），作间接竞争ELISA，曲线斜率较大，对ELISA影响较小的抗体工作量为最佳工作量（图3）结果表明，不同的配比对标准曲线斜率的影响较小，为了减少残留检测中组织对ELISA反应的影响，应尽量较少样品反应量，因此选择样品与抗体的配比为30∶702.1.4 抗原抗体最适竞争反应时间 选择温度37 ℃，分别以30、60、90、120 min 4个时间段进行竞争反应，测其OD490值选择最佳反应时间和温度（图4）结果表明，最佳反应时间为60 min2.2 标准曲线以标准品吸光值的平均值除以0 ng/mL标准的吸光值为抑制率（B/B0），以抑制率（B/B0）为纵坐标，以QCA溶液浓度的对数值（lg[QCA]）为横坐标，绘制标准曲线（图5）从图5可知，在0.2～51.2 ng/mL之间，曲线呈良好的线形关系而且斜率也较大拟和的线性回归直线方程为y=-0.240 3x+0.665 4，R2=0.991 1，符合线性关系的判断标准，其中y为B/B0，x为lg[QCA]。

依据标准曲线，可得到相应的lg[QCA]，从而可知其残留量2.3 回收率猪肌肉和猪肝脏样本添加QCA浓度为1、5、20 μg/kg，按照前述方法处理后进行间接竞争性ELISA，其回收率和变异系数测定结果见表1表1结果表明，猪肉、猪肝组织中添加回收率为47.4%～87.7%，批间变异系数均<30%，符合我国卡巴氧残留酶联免疫检测要求3 小结与讨论目前国内外广泛使用的测定卡巴氧及其标示物残留量的方法均是色谱法，这些方法不仅需要昂贵的仪器，而且对技术要求较高，不适合在基层推广应用免疫检测技术具有简便、快速、灵敏的特点，因此近十多年来在食品中兽药残留检测方面取得了迅速的发展 本研究首次报道了卡巴氧残留标示物QCA残留的酶联免疫检测方法，由于QCA分子量较小，分子。