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基因诊断基因诊断Gene DiagnosisGene Diagnosis人类疾病的原因•内因：内因： 基因结构改变（基因结构改变（基因突变基因突变））——点突变、点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩增插入、缺失、重排、易位、基因扩增 基因结构多态性基因结构多态性 基因表达异常基因表达异常•外因：外因： 病原体的侵入病原体的侵入对于疾病的诊断依据：对于疾病的诊断依据：•临床表现临床表现•实验室诊断技术：实验室诊断技术： 细胞学检查细胞学检查 生物化学代谢产物和酶的活性变化检查生物化学代谢产物和酶的活性变化检查 免疫学检验免疫学检验 基因诊断基因诊断一、基因诊断概述(一一) 基因诊断的基因诊断的概念与特点概念与特点(二二) 基因诊断的基因诊断的基本原理基本原理与与临床意义临床意义(一)基因诊断的概念与特点1．概念：．概念：          指利用分子生物学技术，从指利用分子生物学技术，从DNA或或RNA水平检测水平检测基因的存在、分析基因的基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态，结构变异和表达状态，对对疾病疾病作出诊断作出诊断的方法和过程。

的方法和过程•基因诊断以基因诊断以DNA和和RNA为诊断材料，为诊断材料，       •              DNA诊断诊断•              RNA诊断诊断2．基因诊断的特点：（（1）直接检测基因，属病因诊断，）直接检测基因，属病因诊断，针对性针对性强；强；（（2）特异性强、灵敏度高：）特异性强、灵敏度高：由于基因诊断由于基因诊断采用核酸分子杂交、聚合酶链反应等技采用核酸分子杂交、聚合酶链反应等技术；术；（（3）适用范围广：）适用范围广：其应用的范围已从原先其应用的范围已从原先局限的遗传性疾病扩大到感染性疾病、局限的遗传性疾病扩大到感染性疾病、肿瘤、心血管疾病等领域肿瘤、心血管疾病等领域 基因诊断的评价基因诊断的评价•特异性特异性•灵敏度灵敏度•重复性重复性•快速快速•经济经济(二)基因诊断的基本原理与临床意义 1．基本原理：．基本原理： 通过检测通过检测致病基因（包括内源基因与外源基因）致病基因（包括内源基因与外源基因）的的存在、量的多少，结构变化与否及表达水平是否正常，存在、量的多少，结构变化与否及表达水平是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据。

为疾病确诊的依据2．临床意义．临床意义: • 对有表型出现的疾病作出对有表型出现的疾病作出明确诊断明确诊断• 早期快速诊断早期快速诊断• 确定个体对疾病的易感性确定个体对疾病的易感性•疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等 二、基因诊断的常用技术与方法(一一) 基因诊断的常用技术基因诊断的常用技术(二二) 基因诊断的基本方法基因诊断的基本方法(一)基因诊断常用技术1. 1.核酸分子杂交核酸分子杂交2.2.PCRPCR（聚合酶链式反应）（聚合酶链式反应）3.3.限制性酶切分析限制性酶切分析4.4.SSCPSSCP（单链构象多态性分析）（单链构象多态性分析）5.5.DNADNA 测序测序 6.6.DNADNA 芯片技术芯片技术基因诊断技术分类1、Molecular hybridization： Southern, Northern, dot blot, 2、PCR3、DNA测序4、DNA芯片技术1. 1. 核酸分子杂交核酸分子杂交Molecular hybridizationMolecular hybridization•Southern blot——DNA•Northern blot——RNA•Dot blot，•In Situ Hybridization, 核酸杂交的基本原理：核酸杂交的基本原理：利用核酸变性和复性理论：（利用核酸变性和复性理论：（1）双链）双链DNA分子在某些理化因素作用下解旋，分子在某些理化因素作用下解旋，条件恢复后又可恢复其双螺旋结构；条件恢复后又可恢复其双螺旋结构；（（2）具有互补碱基序列的异源核酸单）具有互补碱基序列的异源核酸单链之间同样可按碱基互补配对原则通链之间同样可按碱基互补配对原则通过氢键结合为双链。

过氢键结合为双链核酸分子杂交的流程示意图•待测核酸制备待测核酸制备滤膜上核酸固化杂 交去除未参与杂交的探针检 测 杂 交 信 号• 制备探针核酸片段探 针 标 记加入标记核酸探针探针的种类探针的种类•DNA 探针:基因组DNA探针;基因探针•cDNA探针:目前应用最广泛的•寡核苷酸寡核苷酸探针(Oligonucleotide probes)•RNA 探针: 不同的探针在应用中有各自的特点,但最重要的是探针的序列选择.而探针序列又是依据待测核酸序列选择的　　对致病性微生物应选用其最保守、最特异的序列；对突变基因的检测，应用含有突变位点的序列或待测基因编码的ｍＲＮＡ序列探针的标记物探针的标记物•放射性标记物放射性标记物v32P，35S，125I，3H•非放射性标记物非放射性标记物v生物素，地高辛，荧光素， 酶， 金属Southern blotNN T T N T T1 1、、Southern blotSouthern blot：用于DNA检测，不但能检测出特异的DNA片段，还能进行定位和测定分子量，可用于基因的限制性内切酶图谱分析、基因突变分析等。

2 2、、Northern blotNorthern blot：杂交用于RNA检测，能对组织细胞中的总RNA或mRNA进行定性和定量分析3 3、、dot blotdot blot：既可检测DNA也或检测RNA，用于基因组中特定基因及其表达的定性和定量分析缺点：特异性较低，不能鉴定所分析的基因分子量4 4、原位杂交、原位杂交：在组织、细胞和染色体水平作核酸定性在组织、细胞和染色体水平作核酸定性和定量分析，并可定位和定量分析，并可定位PCR是在试管内是在试管内利用利用DNA聚合酶聚合酶催化的反应反复催化的反应反复进行同一段进行同一段DNA片段合成的过程片段合成的过程（二）（二）PCR技术是基因诊断的一种技术是基因诊断的一种基础基础技术技术PCR技术的优点技术的优点Ø特异性强特异性强Ø灵敏度高灵敏度高Ø操作简单、省时操作简单、省时Ø对待检原始材料质量要求低对待检原始材料质量要求低Ø高效率的基因扩增技术高效率的基因扩增技术1 1、直接采用、直接采用PCRPCR技术进行基因诊断技术进行基因诊断 通过通过PCRPCR技术扩增特异性的基因，可以确定病原技术扩增特异性的基因，可以确定病原生物基因是否存在或分析疾病相关的体内基因缺失生物基因是否存在或分析疾病相关的体内基因缺失或基因突变或基因突变 2 2、采用、采用PCRPCR产物的限制性片段长度多态性分析产物的限制性片段长度多态性分析（（PCRPCR－－RFLPRFLP））　　基因突变导致的基因碱基组成和顺序发生改变，会　　基因突变导致的基因碱基组成和顺序发生改变，会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有限制在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有限制性内切酶位点消失。

因此，突变基因经相应的限制性内性内切酶位点消失因此，突变基因经相应的限制性内切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，根据这些改变可以判断突变是否存在即限制性片段长根据这些改变可以判断突变是否存在即限制性片段长度多态性技术度多态性技术　　　　PCRPCR－－RFLPRFLP就是利用就是利用PCRPCR技术先将包含待测位点的技术先将包含待测位点的DNADNA片段扩增出来，然后用识别该位点的限制性内切酶片段扩增出来，然后用识别该位点的限制性内切酶水解，根据限制性片段数量和长度作出诊断水解，根据限制性片段数量和长度作出诊断3 3、采用、采用PCRPCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术等位基因特异性寡核苷酸探针技术（等位基因特异性寡核苷酸探针技术（ASOASO））原理：原理： 针对已知突变位点的基因，可以分别针对已知突变针对已知突变位点的基因，可以分别针对已知突变位点的序列，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生位点的序列，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生型探针，与无突变序列互补，另一个为突变型探针，与型探针，与无突变序列互补，另一个为突变型探针，与突变序列互补。

同时设计探针时，突变碱基应位于探针突变序列互补同时设计探针时，突变碱基应位于探针的中央，这样在严格控制杂交和洗脱条件下，只有完全的中央，这样在严格控制杂交和洗脱条件下，只有完全互补的探针保留下来，形成稳定杂交分子，而中央碱基互补的探针保留下来，形成稳定杂交分子，而中央碱基与靶序列不匹配的探针则被洗脱与靶序列不匹配的探针则被洗脱 PCR/ASO则是采用则是采用PCR扩增受检者基因的目标扩增受检者基因的目标片段，并与相应的片段，并与相应的ASO探针杂交，如果受检者探针杂交，如果受检者DNA扩扩增的产物与正常探针杂交，而不与突变探针杂交，表增的产物与正常探针杂交，而不与突变探针杂交，表示受检者不存在突变基因；如果只有突变探针可以杂示受检者不存在突变基因；如果只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子；如果两者都存在，则说交，说明突变基因为纯合子；如果两者都存在，则说明突变基因为杂合子明突变基因为杂合子采用采用PCRPCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术 βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS 正常探针 突变探针4 4、、PCRPCR产物的反相点杂交分析技术产物的反相点杂交分析技术 此项技术与此项技术与PCR/ASOPCR/ASO技术原理完全相同，只是杂技术原理完全相同，只是杂交时采用的是反相杂交。

是将探针固定在膜上成为固交时采用的是反相杂交是将探针固定在膜上成为固定相，用定相，用PCRPCR产物作为液体相，进行杂交实验产物作为液体相，进行杂交实验 单链构象多态性（单链构象多态性（SSCPSSCP））分析是一种基于单链分析是一种基于单链DNADNA构象差别来检测点突变的方法构象差别来检测点突变的方法DNADNA经变性形成单经变性形成单链后，在中性条件下单链链后，在中性条件下单链DNADNA会因其分子内碱基之间的会因其分子内碱基之间的相互作用，形成一定的立体构象相同长度的单链相互作用，形成一定的立体构象相同长度的单链DNADNA会因分子内碱基组成或排列顺序不同，形成的构象就会因分子内碱基组成或排列顺序不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性对长度相同而不同，这样就形成了单链构象多态性对长度相同而构象不同的单链构象不同的单链DNADNA在非变性聚丙烯胺凝胶电泳中表现在非变性聚丙烯胺凝胶电泳中表现出不同的迁移率出不同的迁移率 5 5、采用、采用PCRPCR产物的单链构象多态性分析进行基因诊断产物的单链构象多态性分析进行基因诊断 PCR-SSCPPCR-SSCP技术就是利用技术就是利用PCRPCR扩增目的扩增目的基因片段，通过变性成为单链，然后进基因片段，通过变性成为单链，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变会造成苷酸的改变会造成DNADNA片段构象的改变，片段构象的改变，其迁移率也会改变，从而检测基因的突其迁移率也会改变，从而检测基因的突变。

变 该技术是先制备浓度从低到高的变性剂的凝胶，该技术是先制备浓度从低到高的变性剂的凝胶，然后将待测分析的然后将待测分析的PCRPCR扩增产物进行电泳，到扩增产物进行电泳，到DNADNA电泳电泳到变性剂浓度能使到变性剂浓度能使DNADNA发生变性的位置时，发生变性的位置时，DNADNA双链分双链分开，由于不同开，由于不同DNADNA片段的碱基组成不同，因此在凝胶中片段的碱基组成不同，因此在凝胶中泳动发生变性的位置不同，迁移率也不同，因此可以泳动发生变性的位置不同，迁移率也不同，因此可以将相同长度但碱基组成不同的将相同长度但碱基组成不同的DNADNA片段分开，从而能检片段分开，从而能检测出基因的突变测出基因的突变6 6、采用、采用PCRPCR结合变性梯度凝胶电泳技术结合变性梯度凝胶电泳技术 DNADNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。

如在一般正常的细胞中，基因调控区如在一般正常的细胞中，基因调控区C CP PG G岛处于非岛处于非甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往呈甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往呈现甲基化状态因此现甲基化状态因此DNADNA甲基化研究是一热点甲基化研究是一热点7 7、甲基化特异性、甲基化特异性PCRPCR技术技术 将将DNADNA先用亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶先用亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后行引物特异性转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后行引物特异性的的PCRPCR在在MS-PCRMS-PCR中设计两对引物，一对为甲基化特异中设计两对引物，一对为甲基化特异性的引物（性的引物（primerⅠprimerⅠ），），一对为非甲基化的引物一对为非甲基化的引物（（primerⅡprimerⅡ），），进行特异性的扩增，只有结合完全的进行特异性的扩增，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物，甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物，最终可以确定研究最终可以确定研究DNADNA片段部位的甲基化情况。

片段部位的甲基化情况甲基化特异性甲基化特异性PCRPCR技术（技术（ MS-PCRMS-PCR ））•以上介绍的基于以上介绍的基于PCR扩增技术建立的基扩增技术建立的基因诊断技术，只能提供定性结果，即有因诊断技术，只能提供定性结果，即有无突变但对基因表达异常的疾病，上无突变但对基因表达异常的疾病，上述方法无法满足需要，还需要研究其基述方法无法满足需要，还需要研究其基因的表达量上的变化分析，故还可运用因的表达量上的变化分析，故还可运用PCR定量分析基因表达定量分析基因表达•PCR定量分析方法有：定量分析方法有：梯度（系列）稀梯度（系列）稀释法、释法、极限稀释法、非竞争性对照法、极限稀释法、非竞争性对照法、竞争抑制法竞争抑制法 、、 荧光定量荧光定量PCRPCR8 8、采用、采用PCRPCR技术进行靶核酸的定量分析技术进行靶核酸的定量分析PCR扩增有限性扩增有限性-平台期及平台平台期及平台    效应（效应（plateau effect））   PCR扩增的扩增的平台效应平台效应梯度（系列）稀释法：梯度（系列）稀释法：¡在在扩扩增增检检测测待待测测样样本本的的同同时时，，扩扩增增一一系系列列稀稀释的已知标准（通常为质粒释的已知标准（通常为质粒DNADNA））¡如如果果在在该该标标准准稀稀释释系系列列范范围围内内，，扩扩增增产产物物/ /模模板板成成线线性性相相关关，，则则可可推推导导出出同同时时扩扩增增的的待待测样本中测样本中PCRPCR模板的相对量模板的相对量. .¡必须在扩增的必须在扩增的指数期指数期进行进行¡优点：简单，可作粗糙的定量分析。

优点：简单，可作粗糙的定量分析¡缺缺 点点 ：： 不不 准准 确确 ，， 影影 响响 因因 素素 多多 首先将原始模板进行梯度稀释首先将原始模板进行梯度稀释; ;然后对该稀释系列进行然后对该稀释系列进行PCRPCR扩增测定扩增测定; ;最低的阳性样本被认为含有与一已知的标准稀最低的阳性样本被认为含有与一已知的标准稀释系列中最后的阳性样本中相同量的释系列中最后的阳性样本中相同量的PCRPCR模板模板基本依据：基本依据：PCRPCR扩增的有效起始模板分子数为扩增的有效起始模板分子数为10104 4～～10106 6个个改良方法：极限稀释分析改良方法：极限稀释分析非竞争性对照基因定量法非竞争性对照基因定量法 该定量法是靶基因与参照基因的同步扩增即在同样的反应条件下，在一个试管内同步扩增来自同一DNA 的一段靶序列和另一段内标序列(通常是管家基因或它们的mRNA)通过比较两种序列的扩增产物电泳带的颜色强度对靶基因定量 竞争PCR 与前述方法相似，即靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参照标准通常是一段人工合成的模板而不是内源性基因竞争PCR 必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分子，具有相同的引物结合位点，其扩增产物能通过电泳或高效液相色谱(HPLC)等方法区分开来。

将竞争模板作系列稀释后，加入到恒量的样品DNA进行PCR，通过分离和分析竞争模板与样品DNA产量，对样品DNA进行定量分析竞争性竞争性PCR：：3. DNA sequencingDNA序列测定是最直接、最准确的基序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术因诊断技术例：四色荧光自动测序分析结果例：四色荧光自动测序分析结果4.DNA4.DNA芯片技术芯片技术DNA chips or microarrayDNA chips or microarray 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息） 由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术DNA芯片技术的概念DNA芯片技术原理•大规模集成的固相杂交大规模集成的固相杂交 •基基本本原原理理是是核核酸酸分分子子杂杂交交，，即即依依据据DNADNA双双链链碱碱基基互互补补配配对对、、变变性性和和复复性性的原理的原理 ¡以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略 人类疾病多种多样，致病原因不同，因此在基人类疾病多种多样，致病原因不同，因此在基因诊断上也有不同途径和策略。

因诊断上也有不同途径和策略 1 1、对致病基因已经找到、发生机制清楚的疾病，、对致病基因已经找到、发生机制清楚的疾病，可以通过直接检测致病基因进行基因诊断可以通过直接检测致病基因进行基因诊断 如：病原微生物的感染：病毒、细菌、寄生虫、如：病原微生物的感染：病毒、细菌、寄生虫、真菌等，及与疾病有关的机体内源性基因：癌基因、真菌等，及与疾病有关的机体内源性基因：癌基因、抑癌基因、病理基因抑癌基因、病理基因 2 2、对致病基因还没找到，发生机制也没有完全、对致病基因还没找到，发生机制也没有完全清楚，但致病基因已定位于染色体或基因组的清楚，但致病基因已定位于染色体或基因组的特定区域的疾病，可以通过检测致病基因的联特定区域的疾病，可以通过检测致病基因的联锁遗传标记进行基因诊断锁遗传标记进行基因诊断 如：用限制性内切酶位点作为遗传标记，如：用限制性内切酶位点作为遗传标记，利用该遗传标记与相邻的基因在遗传过程中分利用该遗传标记与相邻的基因在遗传过程中分离几率很低，常常一起遗传，形成连锁特点，离几率很低，常常一起遗传，形成连锁特点，建立了染色体基因连锁图，根据基因连锁图，建立了染色体基因连锁图，根据基因连锁图，通过分析连锁基因的遗传标记，可判断致病基通过分析连锁基因的遗传标记，可判断致病基因存在的可能性。

因存在的可能性第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略3 3、对多因素、多基因疾病，可以通过检测表型、对多因素、多基因疾病，可以通过检测表型克隆基因进行基因诊断克隆基因进行基因诊断第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略如高血压、冠心病、肿瘤、精神病、自身免疫性疾病，由于疾病发生的原因复杂，涉及多基因、多因素因此可采用表型克隆方法来分析诊断原理：从分析正常和异常基因组采用差异显示等技术找到正常人和疾病患者之间的差异序列，进行克隆根据克隆的一组基因差异序列制作相应探针，用制备的这一组探针检测相关疾病的方法第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略4 4、对一些因基因表达异常出现的疾病，可通、对一些因基因表达异常出现的疾病，可通过基因表达的定量分析进行基因诊断过基因表达的定量分析进行基因诊断 对与基因表达异常出现的疾病，可以在转对与基因表达异常出现的疾病，可以在转录水平上对该基因的表达的录水平上对该基因的表达的mRNAmRNA量进行分析，量进行分析，作出诊断作出诊断第三节第三节 基因诊断的应用前景基因诊断的应用前景1.杂交基础上的杂交基础上的RFLP分析（分析（20世世纪纪80年代年代））2.PCR及其衍生技术及其衍生技术3.基因芯片技术基因芯片技术基因诊断的发展历史基因诊断的发展历史第三节第三节 基因诊断的应用前景基因诊断的应用前景1.理论理论2.技术技术3.伦理伦理基因诊断过程中存在的问题基因诊断过程中存在的问题 遗传病的基因诊断是在基因水平上对核遗传病的基因诊断是在基因水平上对核酸碱基序列突变的检测，从遗传物质的分子水酸碱基序列突变的检测，从遗传物质的分子水平上揭示疾病的发生原因和分子机制。

平上揭示疾病的发生原因和分子机制 遗传病的诊断分为产前检查、症状前诊断遗传病的诊断分为产前检查、症状前诊断和症状后诊断遗传病的基因诊断是进行产前和症状后诊断遗传病的基因诊断是进行产前检查和症状前诊断的唯一选择，也是遗传病预检查和症状前诊断的唯一选择，也是遗传病预防最为有效的手段防最为有效的手段第四节、基因诊断技术检测遗传病第四节、基因诊断技术检测遗传病•基因诊断技术途径：•①直接分析致病基因分子结构及表达是否异常的直接诊断途径；•②利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析的间接诊断途径第四节第四节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断第四节第四节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因                       必要条件必要条件①①被检基因的突变类型与疾病发病有直接被检基因的突变类型与疾病发病有直接的因果关系：的因果关系：②②被检基因的正常分子结构已被确定；被检基因的正常分子结构已被确定；③③被检基因突变位点固定而且已知被检基因突变位点固定而且已知• 1.点突变：•（1）导致特异性限制性内切酶位点改变 直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因•血红蛋白病可以由血红蛋白结构或合成异常所血红蛋白病可以由血红蛋白结构或合成异常所致的遗传性疾病。

前者称为异常血红蛋白病，致的遗传性疾病前者称为异常血红蛋白病，后者称为地中海贫血后者称为地中海贫血•针对异常血红蛋白病如镰刀状红细胞贫血症是针对异常血红蛋白病如镰刀状红细胞贫血症是由于由于 珠蛋白珠蛋白基因的第基因的第6 6位密码子位密码子GAGGAG突变成突变成GTGGTG，，导致蛋白结构异常对此导致蛋白结构异常对此遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断可采用可采用PCR-PCR-限制性内切酶分析技术限制性内切酶分析技术镰状红细胞贫血镰状红细胞贫血HBS-Beta株蛋白基因突变：株蛋白基因突变：×5´3´正常基因正常基因5´3´突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析PCR-RE分析 MstII CCTGAGG-CCTGTGG+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析•1.点突变：（2）无限制性酶切位点改变 直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因        PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交斑点杂交或反向斑点杂交等技术。

等技术PCR-ASO斑点杂交或反向斑点斑点杂交或反向斑点杂交技术可快速、简易地检测已知突变杂交技术可快速、简易地检测已知突变 Β地中海性贫血基因诊断（PCR-ASO） 已知突变已知突变GeneGene部位和性质，合成寡和苷酸部位和性质，合成寡和苷酸探针，探针，3232P P标记，进行标记，进行Southern Blot Southern Blot 杂交杂交/ /斑斑点杂交 Normal βΑGene Probe——与正常与正常βΑ杂交杂交Mutation βS S Gene Probe——与异常与异常βS杂交杂交 βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS 正常探针 突变探针1 1、、Gene Gene 缺失遗传病的诊断缺失遗传病的诊断•1）α地贫的Gene诊断•α基因不同程度的缺失引起不同类型的α地贫，α基因缺失1～4个。

正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个α Gene时可得到10kb片段BamHIBamHIα2α1α2 10 kb14 kbprobe以以αGeneαGene为探针，为探针，Southern blot Southern blot 方法方法检测检测•αα/αα αα/α- αα/- - α- /- - - - / - -• 正常 缺1 缺2 缺3 缺414kb10kb直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因        在在DNA序列上有较长一段序列的重新排布序列上有较长一段序列的重新排布包括大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢包括大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢失、插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变失、插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变进而引起更大范围内的染色体结构上的改变从而进而引起更大范围内的染色体结构上的改变从而影响多个基因的功能，即染色体突变或畸变，包影响多个基因的功能，即染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等征）等 •2.基因重排\缺失 ：核酸分子探针杂交与PCR       （（1））Southern 印迹杂交、斑点杂交、原位杂印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号区域，而检测不到杂交信号       （（2）多重）多重PCR，，1988年年Chamberlain等采用等采用多重多重PCR技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养不良蛋白基因的多个基因座不良蛋白基因的多个基因座 直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因杜氏肌营养不良症的基因诊断杜氏肌营养不良症的基因诊断 DMD DMD是一种严重致死性疾病（是一种严重致死性疾病（XRXR），），临床临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。

症状表现肌肉进行性萎缩和乏力 病因是抗肌萎缩蛋白基因突变所致病因是抗肌萎缩蛋白基因突变所致Gene Gene 定位定位Xp21 Xp21 ，， Gene 2300kb,79 Gene 2300kb,79 个个Exon Exon ，，cDNAcDNA全长全长1397413974bpbp，，编码编码3685 3685 AaAa，，分子量分子量427427kDkD DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占60%~70%1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇 1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇4. 胎儿 5. 阴性对照 4. 胎儿 5. 阴性对照采用多重采用多重PCRPCR法扩增该基因的多个外显子法扩增该基因的多个外显子•3. 基因表达异常•mRNA的相对定量分析•mRNA长度分析直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因 二、二、遗传病遗传病间接诊断间接诊断 当致病基因虽然已知，但其异常性质未知时，或疾病Gene本身尚未知时，主要通过Gene和遗传标记遗传标记的连锁分析间接地作出诊断。

连锁分析基于连锁分析基于遗传标记遗传标记与与Gene在染色体上连锁，在染色体上连锁， 通过通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种遗传标记遗传标记与与疾病疾病的关系，间接推断受检的关系，间接推断受检子代是否获得带有致病基因的染子代是否获得带有致病基因的染色体色体，间接地判断并做出诊断间接地判断并做出诊断 遗传标记（限制性片段长度多态性、微卫星遗传标记（限制性片段长度多态性、微卫星DNADNA序列、单核苷酸多态性等）序列、单核苷酸多态性等）1 1 Southern blotSouthern blot--RFLP--RFLP诊断诊断( (PKU)PKU) PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb 两种等位片段，以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交间接基因诊断间接基因诊断•患者为患者为19kb片段的纯合子片段的纯合子,说明患者缺说明患者缺陷的陷的PAH基因与基因与19kb片段连锁片段连锁•其父、母亲缺陷的其父、母亲缺陷的PAH基因与基因与19kb片段片段连锁，其连锁，其23kb片段与正常片段与正常PAH基因连锁。

基因连锁•II2为23kb 和和19kb片段的杂合子，为表片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者型正常的致病基因携带者间接基因诊断间接基因诊断成年型多囊肾病成年型多囊肾病的基因诊断的基因诊断•例：成年型多囊肾病——APKD，AD ，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石最终导致肾功能衰竭和尿毒症•APKD——Gene定位16p13.3，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKD Gene与α珠蛋白基因3`端附近的一段小卫星DNA序列（3`HVR）紧密连锁，因此，可以通过RFLP连锁分析进行诊断    以以3`HVR为为探探针针，，与与PvuII酶酶切切后后的的家家系系有有关关成成员的基因组员的基因组DNA进行进行Southern Blot         基因组基因组DNAPvuII酶切酶切DNA片段片段变性变性转膜转膜探针探针变性变性杂交杂交结果分析结果分析间接基因诊断间接基因诊断结 果 1 2 1 2 3 4 5 5．．7kb 3．．4kb 2．．3kb 结果分析结果分析•患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,说明致病基因与3.4kb片段连锁,并按孟德尔方式遗传.II5不含3.4kb片段,产前诊断正常. 遗传疾病的基因诊断方法基因异常基因异常 方法方法 探针、引物或限制酶探针、引物或限制酶 基因组基因组DNA印迹杂交印迹杂交 缺失基因的探针缺失基因的探针 基因缺失基因缺失 PCR扩增扩增 引物包括缺失或在缺失部位内引物包括缺失或在缺失部位内 RFLP分析分析 突变导致其切点消失的限制酶突变导致其切点消失的限制酶点突变点突变 ASO杂交杂交 正常和异常的正常和异常的ASO探针探针 PCR产物的多态性分析（产物的多态性分析（SSCP））引引引物包括突变部位引物包括突变部位基因未知基因未知与与疾病连锁的多态性分析疾病连锁的多态性分析 与疾病连锁的多态位点与疾病连锁的多态位点 探针或引物探针或引物肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断 肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素；发生过程呈多阶段性，其发生发展机制十分复杂，同时不同的肿瘤发生机制也不相同，因此在肿瘤的基因诊断时，无法采用统一的策略。

策略一、通过检测肿瘤染色体异位及融合基因诊断 淋巴造血系统肿瘤中,染色体异位和重排发生较为普遍.临床上出现的炎症性淋巴结肿大与淋巴瘤肿大的鉴定: 在淋巴瘤细胞中，T细胞受体（TCR）基因和IgH基因发生重排，原来相隔数百个碱基的IgH基因和TCR基因的V区和J区基因就会靠近在一起，而炎症增生性细胞内就不会发生基因重排，故通过PCR扩增可以鉴定之策略二、通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤 癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤发生发癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤发生发展关系密切多数肿瘤组织或肿瘤细胞中都检测到展关系密切多数肿瘤组织或肿瘤细胞中都检测到癌基因与抑癌基因的突变用基因诊断方法：定量癌基因与抑癌基因的突变用基因诊断方法：定量PCRPCR、、印迹技术、印迹技术、PCR-SSCPPCR-SSCP等检测 如如rasras癌基因，其激活的分子机制主要是点突变，癌基因，其激活的分子机制主要是点突变，因此可通过因此可通过PCR-ASOPCR-ASO、、PCR-SSCPPCR-SSCP等方法 P53P53基因是抑癌基因，在肿瘤组织中其常发生突基因是抑癌基因，在肿瘤组织中其常发生突变而失活。

因此可通过变而失活因此可通过PCR-SSCPPCR-SSCP、、DNADNA测序分析等，测序分析等，可检测可检测P53P53基因的突变基因的突变策略三、通过检测肿瘤相关病毒诊断肿瘤鼻咽癌Burkitt淋巴瘤肝癌宫颈癌EB病毒HBV、HCV人类乳头瘤病毒HPV策略四、检测肿瘤标记物基因或策略四、检测肿瘤标记物基因或mRNAmRNA诊断肿瘤诊断肿瘤 肿瘤标记物是肿瘤组织中产生的与肿瘤发肿瘤标记物是肿瘤组织中产生的与肿瘤发生发展过程相关的物质如肿瘤抗原、激素、生发展过程相关的物质如肿瘤抗原、激素、酶等因此通过特异的肿瘤标记物基因的检测，可以因此通过特异的肿瘤标记物基因的检测，可以帮助对肿瘤的诊断帮助对肿瘤的诊断肝癌肝癌—甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP））结肠癌结肠癌—癌胚抗原癌胚抗原（（CEA））基因诊断在感染性疾病中应用基因诊断在感染性疾病中应用• 定性或定量检测致病微生物的核酸定性或定量检测致病微生物的核酸，， 已经用于病毒、细菌和寄生虫感染已经用于病毒、细菌和寄生虫感染 的诊断• 动态、定量地检测病原体核酸能动态、定量地检测病原体核酸能对对 疗效判断和病情预后疗效判断和病情预后提供客观的依提供客观的依 据。

据SARS相关冠状病毒的分子诊断• 2003年4月，香港研究者Peiris等报 告了50 例SARS病人的临床表现和 病毒学研究结果证明，新冠状病毒 可能是SARS的致病原因 （Lancet, 2003, 361: 9365)• 其它实验室陆续得出相同结论• 2003年年4月，德国汉堡月，德国汉堡Bernhard-     Nocht热带医学研究所学者热带医学研究所学者 Drosten    等用随机扩增技术，获得长度为等用随机扩增技术，获得长度为    300 bp的核苷酸序列的核苷酸序列• 根据这段序列，建立了检测新冠状根据这段序列，建立了检测新冠状     病毒的常规和实时定量病毒的常规和实时定量PCR技术org on April 10, 2003））•1. 1. 血清学方法：血清学方法：ELISAELISA（（IgM/IgAIgM/IgA））方法能够可靠地检出出方法能够可靠地检出出现临床症状现临床症状2020天后天后SARSSARS病人血清中的病毒抗体某些病人病人血清中的病毒抗体某些病人在在14-2114-21天时，已经可以检测到抗体天时，已经可以检测到抗体。

•2.2.  细胞培养方法：利用细胞培养方法：利用VEROVERO细胞来检测细胞来检测SARSSARS病人的呼病人的呼吸道分泌物和血液样品，阳性结果则表示吸道分泌物和血液样品，阳性结果则表示SARSSARS病人感染了病人感染了冠状病毒冠状病毒•3.3. 分子生物学方法：主要是运用分子生物学方法：主要是运用PCRPCR的方法对血液、粪便、的方法对血液、粪便、呼吸道分泌物、痰液、唾液和漱口液等临床样本的核酸提呼吸道分泌物、痰液、唾液和漱口液等临床样本的核酸提取物进行体外的扩增后，进行定性与定量的分析取物进行体外的扩增后，进行定性与定量的分析检测方法检测方法讨 论• 疾病的早期即可获得阳性结果（早疾病的早期即可获得阳性结果（早     于血清转换期）于血清转换期）• 特异性较高（特异性较高（SARS患者中的阳性患者中的阳性    率约为率约为80%，对照中的阴性率约为，对照中的阴性率约为    98%~100%）• 现有的方法敏感性较差，阴性结果现有的方法敏感性较差，阴性结果    不能排除病毒感染不能排除病毒感染讨 论•痰液中病毒痰液中病毒RNA浓度极高，说明病毒从呼吸道浓度极高，说明病毒从呼吸道    排放是主要传播途径。

排放是主要传播途径•血清中检测到极低浓度的病毒血清中检测到极低浓度的病毒RNA，，提示病毒提示病毒    复制不仅发生于呼吸道复制不仅发生于呼吸道•病人恢复晚期的粪便中存在病毒病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA，，说明粪说明粪    便可能也是一种传播途径便可能也是一种传播途径•鼻、咽拭子中含有的病毒鼻、咽拭子中含有的病毒RNA显著少于痰液，显著少于痰液，    提示不适合作为标本（有可能漏检）提示不适合作为标本（有可能漏检）SARS相关冠状病毒分子诊断中必须注意的问题• 必须在规范的基因扩增实验室中进行必须在规范的基因扩增实验室中进行• 应采取必要的质控规程，包括阳性对照应采取必要的质控规程，包括阳性对照 和阴性对照和阴性对照• 阳性结果时必须对原始样本重复检验或阳性结果时必须对原始样本重复检验或 者扩增基因的另一个片段或在另一个实者扩增基因的另一个片段或在另一个实 验室对同一样本进行检测验室对同一样本进行检测。