QPCR常见问题及其分析.docx

一般来讲，进行real-time qPCR Mas terMix都是2X的浓缩液， 只需要加入模板和引物就可以由于real-time qPCR灵敏度高，所 以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于 Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析通常来讲，反应体系 的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA 一般是10ng-500,如 果cDNA，通常情况下是lul或者1 ul的10倍稀释液，要根据目的基 因的表达丰度进行调整当然这些都是经验值,在操作过程中,还需 要根据所用M as terMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳 反应体系在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1. Mas terMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差最好能在冰上操作3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4. 所有成分加完后，离心去除气泡5. 每个样品至少3个平行孔参比或者校正染料(reference dye， passive dye)常用的是ROXTM (现在已经是ABI的注册商标了！)或者其他染料，只要不影响检测 PCR产物的荧光值就可以。

参比染料的作用是标准化荧光定量反应中 的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳 定的基线现在很多公司已经把ROXTM配制在Mas terMix或者 Premixture里如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以 不加ROXTM染料校正通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样， 要变性、退火、延伸3步由于其产物长度在80-150bp之间，所以 只需要变性和退火就可以了SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩 增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的 特异性扩增而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是 一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集3. 仪器设置所有仪器的操作都基本一致设置的时候包括反应板设置(plate setup)和程序设置(program setup)我们以 ABI St epOne 为例， 详细看一下反应设置：A. 首先是实验目的选择：定量还是其他我们命名为“BioTeke”， 进行“定量”实验B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法，Fast 程序，以cDNA为模板进行。

C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组以及负对照的 设置和生物重复的设置E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的Mas terMix比如BioTeke的95°C 2分钟就可以激活DNA聚合酶(ABI 的需要10分钟)循环反应是95C15秒，60C15秒的40个循环 溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以或者是仪器说明书上建议的 程序G. 反应体系的设置：A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行 反应需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX有些公 司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开 要根据不同公司的Mas terMix进行这一个步骤的选择BioTeke的 Mas terMix里没有参比染料，所以选择“ none”设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN ！五、Real-time qPCR数据分析1. Real-time qPCR 常见参数基线(baseline)通常是3- 15个循环的荧光信号同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线阈值(t hreshold)自动设置是3- 1 5个循环的荧光信号的标准偏差的1 0倍 手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。

同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩 增一定要用同一个阈值Ct值:与起始浓度的对数成线性关系分析定量时候一般取Ct :15-35太大或者太小都会导致定量的不准 确Rn(Normalized reporter)是荧光报告基团的荧光发射强度与参比 染料的荧光发射强度的比值△Rn：ARn是Rn扣除基线后得到的标准化结果(ARn二Rn-基线)2. 影响Ct值的关键因素模板浓度模板浓度是决定Ct的最主要因素控制在一个合适范围内，使Ct在 15-35之间反应液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响 比如溶液的pH值和盐浓度PCR反应的效率PCR反应的效率也会影响Ct值在PCR扩增效率低的条件下进行连 续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜 率不同的标准曲线PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质 量一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的3. 如何评估实时定量PCR反应的效果PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行 重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度常见问题1. 无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误：一般SG法采用72°C延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性模板量不足： 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起 模板降解： 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况2. Ct值出现过晚（Ct〉38）扩增效率低： 反应条件不够优化设计更好的引物或探针；改用三步 法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等PCR各种反应成分的降解或加样量的不足PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度3. 标准曲线线性关系不佳加样存在误差： 使得标准品不呈梯度标准品出现降解： 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准 品引物或探针不佳： 重新设计更好的引物和探针模板中存在抑制物，或模板浓度过高4. 负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比 镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通 过引物设计避免非特异扩增5. 溶解曲线不止一个主峰 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂 盒模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通 过引物设计避免非特异扩增6. 扩增效率低 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解 反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模 板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？ 判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性 如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分 析8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？参比染料设定不正确（MasterMix不加参比染料时，选NONE） 模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解荧光定量PCR问题汇总1. 定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少 仪器出故障的频率开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机， 等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。

2. 哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平 盖的光学八联管盖ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和 货号见下表：3. 为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小 块当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间 才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断碎片 整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬 盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能碎片整理的方法如下：•在Windows桌面上，选择开始（start），我的电脑（Mycomputer）在（我的电脑）窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择（属性）proper ty・在（属性）对话框中选择工具（Tools）选项卡，单击开始整理 （Defragment now）•单击碎片整理（Defragment）。

・当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）• 在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）• 为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤4. 何时执行 windows service pack 更新？不要执行该操作除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操 作系统，否则请不要更新控制定量PCR仪的计算机的操作系统新 版本的Microsoft Windows操作系统有可能与SDS软件存在冲突， 并导致仪器不能正常运行如果您希望安装service pack （更新包） 以更新操作系统，应查看随SDS软件提供的版本说明，避免兼容性 问题5. 应该备份哪些数据？应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻 录同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景 文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是 C:/Appliedbiosys tems/SDS Documen t下图是校正文件的样本6. 怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行？良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障 的频率推荐做到以下几个方面：电源：推荐配备合适的U PS或稳压器通风：仪器的通风应该没有阻挡。

温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间 湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机 空间：易于操作，安全7. 怎样判断定量per仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示 出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染 清除样本加热块污染的步骤如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中吹打数次将废液吸入废液杯中重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次 确认反应孔中的残留液体蒸发完8. 什么是背景校正？多长时间执行一次背景校正？背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光 强度在运行校正程序期间，定量PCR仪在10分钟内连续读取背景 校正板的荧光强度，信号收集的温度为60°C随后，SDS软件计算 所收集到的荧光强度的平均值，提取结果并保存到校正文件中软件 在今后的分析中将自动调用此校正文件，。