发酵——种子的扩大培养.ppt

第四章 种子的扩大培养种子扩大培养的目的与要求种子制备实例种子制备的技术概要种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处 休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或 摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯 种过程这些纯种培养物称为种子第一节 种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的概念:种子扩培的目的q 接种量的需要q 菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：q 总量及浓度能满足要求q 生理状况稳定，个体与群体q 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长q 无杂菌污染第一节 种子制备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备制备过程斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵1、斜面 (AS1.299)培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5琼脂 2%， pH 7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32℃，生长18-24小时生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次2. 一级种子（摇瓶）培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培养12小时培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%，硫酸镁0.04% pH7.0培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基一级种子质量要求 种龄：12h pH值：6.4± 0.1 光密度：净增OD值0.5以上 残糖：0.5％以下 无菌检查：(-) 噬菌体检查： (-) 镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐 革兰氏阳性反应3. 二级种子(种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32℃培养7-10个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替 ，浓度为2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基通风量: 50L种子罐1:0.5,搅拌转速340r／min；250L种子罐1:0.3,搅拌转速300r／ min500L种子罐1:0.25,搅拌转速230r／ min种子的质量要求：108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列PH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛无菌检查二、青霉素生产的种子制备制备过程安培管→ 斜面孢子 → 大米孢子→ 一级种子→ 二级种子→ 发酵1、斜面孢子培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右2、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米 的白点小）有利于孢子的生长。

培养条件：25℃、7天，控制湿度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子3、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的：长菌体培养条件：27℃，40小时接种量：200亿孢子/吨4、二级种子培养基：同上培养条件：27℃、10-14小时接种量：10%三、啤酒酵母的扩大培养三级扩大培养扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍第2级到第3级为4-6倍 1，实验室扩大培养2，车间扩大培养从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种接种方式：从种子罐接种：种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 Ⅲ—Ⅳ期青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期 ，4-6期合成青霉素的能力最强第二节 种子制备的技术概要一、种子制备的过程实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验 室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因 此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为 发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段二、实验室阶段1、培养物选择的原则目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类：q 对于不产孢子和芽胞的微生物——获得一定数量和质量的菌体对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培 养。

Ø 获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种 子，但操作繁琐q 对于产孢子的微生物Ø 获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制例：放线菌孢子的制备ü采用琼脂斜面培养基，培养基含麸皮、豌豆浸汁、蛋 白胨和一些无机盐等ü培养温度一般为28˚Cü培养时间为5~14天2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产 链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌 可以用摇瓶液体培养法将孢子接入含液体培养 基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌 丝体，作为种子 试管→三角瓶→摇床→种子罐 2、培养基选择的原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基 应该是有利于孢子的生长在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小， 因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较 精细3、起始接种物的传代问题q 细菌保藏斜面 → 活化斜面q 产孢子保藏 → 母斜面 → 子斜面目的：使菌种的传代次数尽可能的少母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。

子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单 菌落②接种时密一点，得到大量的孢子孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月孢子培养三、生产车间阶段1、培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体q 缩短发酵时间q 有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：2、培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应 首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所 以营养要比发酵培养基丰富在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于 发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本 二是驯化例：柠檬酸发酵q 以蔗糖为原料成分 斜面 种子罐 发酵麦芽汁 麦汁 蔗糖 2.5-5% 20% NH4NO3 0.225% 0.11% K2HPO4 0.03% MgSO4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015% 琼脂 2%q 薯干粉成分 斜面 种子罐 发酵麦芽汁 麦汁 薯干粉 10% 22-28% (NH4)2SO4 0.5% 琼脂 2%3、发酵级数的确定谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵青霉素：三级发酵一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数发酵级数确定的依据q 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响q 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。

q 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重 要的一个方面ü细菌：二级发酵茄子瓶→种子罐→发酵罐 ü霉菌：如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发 芽）→二级种子罐（ 27˚C,10~24小时）→发酵罐 ü放线菌：四级发酵ü酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 常用微生物发酵级数：4、接种量的确定移入种子的体积 接种量＝ —————————接种后培养液的体积过大过小都不好，以实践定，如大多数抗生素为7 -15%但是一般认为大一点好 通常接种量：细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有时20~25%双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐 5、种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐 或发酵罐时的培养时间种龄短：菌体太少；种龄长：易老化原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较 大，但是最终由实验结果定嗜碱性芽孢杆菌生产碱性 蛋白酶，12小时最好6、种子的质量要求：量：要求达到一定的浓度质: 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等）理化指标：C、N、P的含量，pH，产物生成量酶活等 无污染单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有 的还要求有一定的排列或形态； 霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力 强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好 。

种子异常分析菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团菌丝粘壁 本章小节：了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念理解种子扩培的目的和要求掌握控制种子质量的基本方法和手段。