磷酸化蛋白质的分析方法.docx

磷酸化蛋白质的分析方法试剂：乙腈(Acetonitrile, ACN)，三氟乙酸(Trifluoroacetic acid, TFA)购自Merck 公司(Darmstadt, Germany)尿素(urea)，氯化钠(Sodium chloride, NaCl) 购自Sigma 公司甲酸(Formic acid, FA)、乙酸(Acetic acid, HAC)购自Aldrich(St. Louis, MO, USA)盐酸胍(Guanidine hydrochloride, GuCl)，二硫苏糖醇 (dithiothreitol, DTT),碳酸氢铵(Ammonium bicarbonate),碘乙酰胺(Iodoacetamide, IAA)购自Bio-Rad (Hercules, CA, USA)胰蛋白酶(Trypsin)购自Promega (Madison, WI)所有的化学品的纯度级别除了乙腈是色谱纯外都是分析纯实 验所用水都经过Milli-Q system (Millipore, Bedford, MA, USA)处理样品制备样品用2D 裂解液裂解(8 M Urea,4% CHAPS,65 mM DTT,40 mM Tris), 100W 30 s超声后，15,000g离心45 min。

取上清，Bradford法定量；取500 “g样 品加入2ul 1M DTT, 于37T还原反应2.5h；再加入10ul 1M IAA于室温避光烷基 化40min100%丙酮沉淀过夜，100mM碳酸氢铵(pH 8.5)溶解样品，按50： 1 加入胰蛋白酶酶解过夜磷酸化多肽的富集：Loading buffer:(饱和 glutamic acid/65% 乙腈/2%TFA)Wash buffer 1: (65% 乙腈/0.5%TFA)Wash buffer 2: (65%乙腈/0.1% TFA)Elute buffer 1: （300mM 氨水/50% 乙腈）1 ．100ul loading buffer 平衡 TiO2 column；2. 200ul loading buffer 溶解样品(2mg)；3.loading sample 到 TiO2 column；4. 100ul loading buffer wash TiO2 column；5.100ul washing buffer 1 wash TiO2 column；6. 100ul washing buffer 2 wash TiO2 column；7. lOOul Elute buffer wash TiO2 column,收集 Flow through，冻干，准备 MS 分析。

质谱分析Surveyor 液相色谱系统与轨道线性离子阱 (Orbi-Trap， Thermo Electron，San Jose, CA)联用进行一维质谱鉴定使用的反相色谱柱为75 /mX 15 cm,填料 为C18(Column Technology, USA)经过色谱柱的流速经过分流后为200 nL/min 使用120分钟的梯度洗脱酶解肽段，从2%到35%缓冲液B (0.1%甲酸的乙腈溶 液)Orbi-trap离子传输毛细管的温度为160 °CNano喷针电压为1.85 kV,碰 撞能量为35%离子阱内的离子数由AGC(automatic gain control)自动控制一级 质谱的扫描范围为400到2000 m/z,二级质谱通过data-dependent模式触发，选择 强度在前十位的离子进行二级质谱分析动态排除的时间为1.5 min, 30 s 内重 复两次搜库：液 相色谱-串联质谱(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）获得的MS/MS数据采用Mascot2.2程序搜索参数设置为：蛋白酶为 胰蛋白酶，最大允许丢失的酶切位点为1个，静态修饰选为半胱氨酸的羧氨甲基 化，动态修饰选为丝、苏、酪氨酸的磷酸化（+79.98 Da）。

母离子质量误差设为 200ppm,碎片离子的质量误差范围为±1 Da我们产生正反库,数据格式由原始的氨基酸序列（正库）与逆向的氨基酸序列 （反库）组成，目的是为了方便对数据的质量评价搜库结果使用实验室编写的软 件进行整合，最终的筛选标准为磷酸化修饰肽段的假阳性率（False positive rate， FPR）均小于1%,母离子误差为1 Oppm。