电针对PCOS模型大鼠性激素及卵巢组织TSP-1表达的影响.docx

    电针对PCOS模型大鼠性激素及卵巢组织TSP-1表达的影响    余小乔　李云君〔Summary〕 目的 探討电针对多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome， PCOS）模型大鼠的治疗作用，以及对卵巢组织中血小板反应蛋白-1（thrombospondin-1， TSP-1）表达的影响方法 将32只雌性SD大鼠随机分为空白组10只、模型组12只、电针组10只，采用1 mg/kg来曲唑加l%羧甲基纤维素灌胃建立PCOS大鼠模型治疗后检测大鼠血清睾酮（testosterone， T）、黄体生成素（luteinizing hormone， LH）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone， FSH）水平，HE染色观察卵巢组织病理结构改变，免疫组化法检测卵巢组织中TSP-1的表达结果 治疗后，电针组大鼠体质量增量和卵巢相对质量较模型组降低（P<0.01），血清T、LH水平及LH/FSH均较模型组降低（P<0.01），卵巢切片可见小囊状扩张卵泡较模型组减少，颗粒细胞层增厚;TSP-1表达于卵巢组织颗粒细胞和卵泡膜细胞的胞浆，模型组TSP-1表达量较低空白组降低（P<0.01），电针组TSP-1表达较模型组升高（P<0.05）。

结论 电针治疗可改善PCOS大鼠性激素紊乱状态，提高卵巢组织中TSP-1的表达，通过调节血管抑制因子、减少卵巢组织中血管新生、改善微循环以达到治疗PCOS的目的〔Key〕 多囊卵巢综合征;电针;性激素;血小板反应蛋白-1〔〕R245       〔文献标志码〕A       〔〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.016Effects of Electroacupuncture on Sex Hormone and Expression of TSP-1 inOvarian Tissue of PCOS RatsYU Xiaoqiao1， LI Yunjun2*（1. Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430061， China; 2. Obstertrics and GynecologyDepartment， Chinese Medicine Hospital of Hubei， Wuhan， Hubei 430061， China）〔Abstract〕 Objective To observe the therapeutic effects of electroacupuncture （EA） on polycystic ovary syndrome （PCOS） model rats and its effects on the expression of thrombospondin-1 （TSP-1） in ovarian tissues. Methods A total of 32 female SD rats were randomly divided into the blank group （n=10）， the model group （n=12）， and the EA group （n=10）. PCOS rat model was established by intragastric administration of 1 mg/kg letrozole dissolved in 1% carboxymethylcellulose （CMC）. After treatment， serum levels of testosterone （T）， luteinizing hormone （LH）， and follicle stimulating hormone （FSH） were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The pathological changes of the ovarian tissue were observed by HE staining. The expression of TSP-1 in ovarian tissues was detected by immunohistochemistry. Results Compared with the model group， the body weight gain and the relative ovarian mass of the EA group were decreased when compared with the model group （P<0.01）， and the serum T， LH levels and LH/FSH were decreased when compared with the model group （P<0.01）. The HE staining of the ovarian tissue showed decreased cystic expansion follicles， and the granular cell layer was obviously thicker. TSP-1 was expressed in the cytoplasm of ovarian tissue granulosa cells and ovarian membrane cells. The expression of TSP-1 was decreased in the model group than in the blank group （P<0.01）. After treatment， the expression of TSP-1 in the EA group was increased when compared with model group （P<0.05）. Conclusion Electroacupuncture can improve the state of sex hormone disorder in PCOS rats， increase the expression of TSP-1， reduce the angiogenesis in ovarian tissue by regulating angiogenesis inhibitors， and improve microcirculation to achieve the purpose of treating PCOS.〔Keywords〕 polycystic ovary syndrome; electroacupuncture; sex hormone; thrombospondin-1多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome， PCOS）是一种常见的妇科疾病，主要是由神经、内分泌及代谢系统失衡引起，它以持续无排卵、卵巢多囊样改变、高雄激素血症等为主要特征[1]。

血管生成在周期性改变的排卵过程中起重要作用，卵泡发育和黄体形成都依赖于毛细血管网生成，而卵巢组织的血流灌注也会随着卵泡发育和激素水平的周期性变化而改变[2]PCOS患者卵巢间质及卵泡囊的血管高度增生，使得卵巢表面呈结节状突起，超声检查可发现其卵巢基质血流增加，血管丰富且清晰，动脉血管阻力低于正常妇女[3]针刺已被证实能够通过调节下丘脑-垂体-卵巢轴改善人体内分泌[4]，有研究发现电针可通过增强梗死灶周围血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）和促血管生成素-1（angiopoietin-1， Ang-1）的表达从而促进缺血区的血管新生[5]，Tal等[6]认为PCOS的血管生成促进因子和抑制因子的动态平衡被打破，导致血管生成处于失调状态TSP家族是重要的血管抑制因子，血小板反应蛋白-1（thrombospondin-1， TSP-1）在卵泡生长、黄体生成、卵巢血管生成等方面发挥着调节功能[7]本文旨在研究PCOS大鼠卵巢组织中TSP-1的表达是否失调以及电针治疗在血管生成方面的影响1 实验材料1.1  动物6周龄SPF级雌性SD大鼠32只，体质量180～200 g，由湖北省实验动物研究中心提供，动物许可证号：SYXK（鄂）2015-0018。

饲养环境：室温18～20 ℃，湿度65%～70%，自由进食饮水本实验过程遵守实验动物福利伦理原则1.2  试剂与药品来曲唑，批号LRAB3683;羧甲基纤维素，批号C-4888，均购自Sigma公司抗体TSP-1，批号bs-2715R，Bioss公司睾酮（testosterone， T）试剂盒，批号E-EL-0072c;黄体生成素（luteinizing hormone， LH）试剂盒，批号E-EL-R0026c;卵泡雌激素（follicle-stimulating hormone， FSH）试剂盒，批号E-EL-R0391c，均购自伊莱瑞特公司1.3  仪器微型高速离心机，C2500-R-230V，美国Labnet;电热恒温培养箱，ICV-450，日本ASONE;全自动酶标仪，Multiskan MK3，美国热电;病理切片机，德国Leica RM;脱水机，俊杰JT-12J;组织摊烤片机，俊杰JK-6;抗原修复用电烤炉，SKG;显微镜，奥林巴斯BX53;低频电子脉冲治疗仪：G6805-2A，上海华谊牌2 实验方法2.1  分组及造模按随机数字表法将大鼠分为3组：空白组、模型组、电针组，模型组12只，其余两组各10只。

空白组用l%羧甲基纤维素灌胃，其余两组参照kafali[8]方法，用1 mg/（kg·d）来曲唑加l%羧甲基纤维素灌胃，连续灌胃30 d2.2  治疗方法电针组取穴参照《实验针灸学》[9]和《大鼠穴位图谱》[10]定位将大鼠置于自制鼠衣中，暴露四肢及腹部，选取后三里：直刺7 mm，左右两侧;三阴交：直刺5 mm，左右两侧;关元：直刺2 mm后三里和三阴交：分别将两侧同名穴的针柄作为一组接至2个电极片上;关元：一个电极片连接关元穴针柄，另一个电极片连导丝缠绕于大鼠尾部中段电针频率为2Hz，连续波，强度以肌肉轻微抖动为度，连续20 min每天1次，9 d为1个疗程，疗程间休息1 d，共3个疗程模型组大鼠置于鼠衣中，只捆绑，不行针刺空白组大鼠常规饲养，不做任何处理2.3  样本收集治疗结束后，于处死前禁食8 h，空腹状态麻醉后，手术开腹采集腹主动脉血，分离血清，置于-20 ℃保存;取出双侧卵巢，称质量后一侧卵巢置于10%甲醛溶液中固定，另一侧卵巢-80 ℃冻存备用脱水后以卵巢最大平面作为待检平面行石蜡包埋，以4 μm厚度进行切片，制作HE染色病理片和免疫组化病理片2.4  指标检测2.4.1  大鼠动情周期检测  造模15 d后，每日上午9点对大鼠进行阴道涂片，镜下观察细胞形态，并判断动情周期的变化。

2.4.2  大鼠體质量以及卵巢相对质量  取出卵巢后称湿重，根据大鼠体质量和卵巢重量计算卵巢相对质量2.4.3  卵巢组织病理形态  卵巢置于10%甲醛溶液中固定，行脱水石蜡包埋后制作HE染色病理切片，于镜下观察卵巢组织病理形态改变2.4.4  血清性激素检测  采集腹主动脉血并分离血清，ELISA法分别测定大鼠血清T、LH、FSH水平，严格按试剂盒说明书操作，测定后计算LH/FSH比值2.4.5  免疫组化法检测卵巢组织中TSP-1的表达  镜下观察免疫组化病理切片中阳性细胞的表达部位在400倍视野下，每张切。