SDS-PAGE13cm.doc

SDS-PAGE凝胶制备1） 准备洁净的玻璃板、灌胶槽、隔板、无尘擦拭纸等试剂；2） 将玻璃板、隔板依次放进灌胶槽，安装好堵漏、固定螺丝等以确保不会发生渗漏，将灌胶槽放置水平面上等待灌胶；3） 进行双向电泳，常规选择12.5%的SDS-PAGE胶，按照前述配方首先将Monomer stock solution、Tris-HCl、SDS、Milli-Q水混合，避光条件下在磁力搅拌器上边搅拌边使用负压抽气15分钟，再加入APS和TEMED搅拌混匀；4） 将混合均匀的凝胶溶液缓缓注入灌胶槽，液面高度至玻璃板上缘5-10mm，避免产生气泡；5） 在胶液面上缓缓加入水饱和正丁醇（Water saturated butanol）将胶面压平，灌好的凝胶在室温静置10 ~ 12个小时待其充分聚合；6） 为慎重起见，进行第二向电泳前，先观察凝胶是否聚合均匀、胶面是否平整、有无气泡等，再开始准备下一步实验IPG胶条的平衡1） 分别配制每10ml含有DTT 100mg或IAA 250mg的SDS equilibration buffer；2） 第一步平衡，在每个装IPG胶条的平衡管中加入10ml含DTT的SDS equilibration buffer，在轨道摇床上缓慢摇动平衡15 min；3） 第二步平衡，在每个装IPG胶条的平衡管中加入10ml含IAA的SDS equilibration buffer，在轨道摇床上缓慢摇动平衡15 min。

2-DE的第二向SDS-PAGE1） 配制SDS-PAGE电泳缓冲液：上槽 (cathode)：SDS electrophoresis buffer (10×) 120ml稀释至700ml，下槽 (anode)：SDS electrophoresis buffer (10×) 350ml稀释至3500ml；2） 使用上槽电泳缓冲液配制琼脂糖封胶液（Agarose sealant、Upper chamber agarose sealant）并加热熔解；3） 用纯水清洗掉SDS-PAGE凝胶玻璃板上的碎胶和胶面上的水饱和正丁醇，加入上槽电泳缓冲液以平衡胶面；4） 准备4mm×8mm大小的滤纸片，在上面滴加标准分子量Marker 10μl后备用；5） 首先将下槽电泳缓冲液约3500ml倒入电泳槽，打开电泳液循环泵和水浴循环泵，将水浴循环温度设置为10℃6） 倒去SDS-PAGE凝胶面上的电泳缓冲液，用滤纸彻底吸干，将温热的Agarose sealant注入胶面上缘空隙直至填满；7） 平衡好的IPG胶条在上槽电泳缓冲液中略微漂洗一下，剪去两端多余的支持膜，在无尘擦拭纸上沾去多余缓冲液后，水平放置在SDS-PAGE凝胶上缘并贴紧玻璃背板，用洁净的尺子将胶条压入Agarose sealant，使IPG胶条水平的附在SDS-PAGE凝胶上缘，如有气泡需挤出；8） 在IPG胶条旁插入带有标准分子量Marker的滤纸片后，再次用温热的Agarose sealant将胶面上缘因放置IPG胶条而产生的空隙填满；9） 将放置好IPG胶条的SDS-PAGE凝胶板依次插入电泳槽，待Agarose sealant冷却凝固后，将上槽（Upper chamber）湿润后水平的压进电泳槽内；10） 用Upper chamber agarose sealant将上槽与凝胶板的接缝处填充，待凝固后即可较好的防止上、下槽间的渗漏；11） 缓缓加入少量上槽电泳缓冲液，确认无渗漏后，加入剩余的上槽电泳缓冲液；12） 接好电泳槽电极，检查无误后打开电泳仪电源，SDS-PAGE程序设置：第一步：20mA，15min第二步：60mA，直至胶内电泳指示剂（Bromophenol blue）跑出凝胶下缘；二向电泳结束后，小心的从电泳槽中取出凝胶板，标记和记录与IPG条相应的二向胶样品编号，需进行染色的凝胶使用专用的尺子将玻璃前板撬开、移去，纯水冲洗掉胶面残留的电泳缓冲液和碎胶后，立即使用染色的固定步骤固定凝胶内的蛋白质斑点；附表：凝胶配方Gel Concentration5%7.5%10%12.5%15%Monomer stock solution16.7ml25ml33.3ml41.7ml50mlTris-HCl (1.5M, pH8.8)25ml25ml25ml25ml25mlSDS (10%)1ml1ml1ml1 ml1mlMilli-Q water56.8ml48.5ml40.2ml31.8ml23.5mlAmmonium persulfate (10%)500μl500μl500μl500μl500μlTEMED33μl33μl33μl33μl33μlTotal volume100ml100ml100ml100ml100mlLWM配制 0.5% agarose: 0.1g agarose + 20ml上槽电泳缓冲液+ 40μl 0.1%BPB 10μl LWM + 20μl Laemmli buffer +30μl 0.5% agarose。