生化综合性设计实验论文.docx

中央民族大学生命与环境科学学院生物化学综合性设计实验报告CTAB法提取菠菜DNACTAB-Method of DNA Extraction in Spinach姓名：付国松 学号：1245°24—年级：12级 专业：...生物科学类一一……… 小组成员 胡雪辰、杨芳、王新凯 指导教师王斌2013年11月25 日CTAB法提取菠菜DNA1.摘要DNA是生命的遗传物质，英国学者F. Griffith[l]( 1928年)以Stretococcus pneumonia肺 炎链球菌，旧称“肺炎双球菌”)对小鼠进行活体实验，为发现 DNA 是遗传物质打下了坚 实的基础1952年，A. D. Hershey和M. Chase发表了证实DNA是噬菌体的遗传物质基础 的著名实验——噬菌体感染实验至此，生命科学研究进入一个崭新的研究时代—— DNA 时代为进一步认识和了解DNA的本质和特征，研究人员研究出多种分离提取DNA的方 法，如氯化铯法、SDS法和一管法等，并在动、植物和微生物的DNA研究中运用然而这 些 DNA 提取方法有较高的成本以及较大的污染性随着这一技术逐步改进 ,如 Sagha-iM aroof等研发出十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法用于提取植物DNA等，使得DNA的提取相 对较为快捷， 提取的质量提高。

在众多的DNA提取方法中，发现CTAB法是一种较为理想的提取植物DNA的方法 根据实验室的设备以及药剂的具体情况，我组选择以菠菜为原料，利用操作简便且效果较好 的CTAB法进行DNA的提取实验2. 实验目的(1) 学习CTAB法提取植物DNA并掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法；(2) 利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取植物叶片中DNA的操作方法提取菠菜DNA 以及凝胶电泳法检验DNA的提取结果3. 实验原理(1) 采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤 其是氧化酶类)，其对 DNA 的抽提产生不利的影响，所以在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂 或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少 研磨过程中各种酶类的作用2) CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离 子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物该复合物在高盐的溶液中(>0.7mol/L NaCl) 是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀CTAB能溶 于乙醇)即可使核酸分离出来。

3) CTAB 溶液在低于 15 度时会形成沉淀洗出，因此再将其加入冰冷的植物材料中 之前必须预热(65度)，且离心温度不要低于15度久DNA/HindIII在1.0%琼脂糖凝胶电泳效果图;4. 实验仪器、试剂及其他4.1仪器设备研钵、离心机、水浴锅、天秤、灭菌锅、移液枪和电泳仪 4.2化学试剂与材料4.2.1 试剂NaCl; EDTA; Tris; HCl; CTAB; 0.7%疏基乙醇;液氮; 2%CTAB 抽提缓冲液;酚-氯仿 -异戊醇（25:24:1）；异丙醇（一20°C，预冷）；无水乙醇；氯仿-异戊醇（24:1）、液氮4.2.2 材料菠菜4.3 DNA 提取缓冲液4.3.1 1mol/L Tris-Cl 的配制：12.11g Tris碱；ddH20 80ml； HCl 4.9 ml三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至&0, 定容至 100ml4.3.2 0.5M EDTA 的配制：在80ml水中加入18.01gEDTANa2.2H20搅拌溶解，用NaOH调PH 至 8.0 （约2gNaOH颗粒）, 定容至 100ml4.3.3 5M NaCl 的配制：称取 29.22g NaCl,用 ddH2O 定容到 100ml4.3.4 2%CTAB 提取液的配制：最终浓度试剂名用量2%CTAB2 g1.4mol/L5mol/L NaCl28 mL20mmol/L0.5 mol/L EDTA pH 8.04 mL100mmol/L1mol/L Tris-HCl pH8.010mL5. 实验步骤5.1 DNA 提取1.2%CTAB抽提缓冲液，0.7%疏基乙醇，65°C水浴加热少量叶片置于研钵中加液氮，小杵磨至粉状（注意：操作迅速，防止DNA氧化）加1ml的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻晃动摇匀置于65C水浴槽，隔5min轻摇，45min后取出冷却2min后，加等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）振荡2-3min,混合均匀1mL氯仿-异戊醇（24:1）抽提一次12000rpm离心6min，移液器轻轻吸上清液至另 新灭菌离心管中加入2/3倍体积异丙醇(-20，预冷)，将离心管慢慢上下摇30slOOOOrpm离心lmin，倒掉液体，注意勿将DNA沉淀倒出加400M无水乙醇，洗涤DNA (植物色素)lOOOOOrpm离心30s,倒掉液体，干燥DNA (可自然 风干)加50 LddH0 使DNA溶解琼脂糖凝胶电泳5.2 制胶(1)称取0.4g的琼脂糖，置于三角瓶中，加50ml 1XTAE作溶剂；( 2)加热使琼脂糖完全溶解;( 3)将胶槽洗净，两端用橡皮胶紧密封住，至于水平支持物上，插上样品梳子，梳子下缘 与胶槽底面保持 1mm 左右的间隙；(4) 待胶液冷却到60°C时(温度过高会使有机玻璃变形)，加入2.5p l的溴化乙锭母液，使其最终浓度为0.5p g/ml，将琼脂倒入胶槽内，注意速度;(5) 当凝胶完全冷却凝固后，除去橡皮条和加样梳，将胶槽放入电泳槽中，样品孔在阴极端(6) 向电泳槽中加入电极缓冲液(1 X TAE)至恰好没过胶面。

5.3 上样电泳(1)按下表进行加样序号1234样品九DNAHindlllDNA溶液DNA溶液DNA溶液体积10pL5|J L8|J L1O|J L6x上样缓 冲液(含 荧光染料 )2yL1yL1.5yL2gL(2)加完样后，合上电泳槽盖，接通电源控制电压在100V，电泳50min3.用凝胶成像仪照相并分析6. 实验结果1 2 3 4 m 1 3 4图1用CTAB法提取到的菠菜片中的DNA( 1%的琼脂糖电泳检测)7.分析与讨论7.1 实验分析(1)我组分离出的DNA大小为23130bp,实验基本成功然而由结果可以看出，我组所提取的DNA中明显掺有杂质(杂质可能为蛋白质、多糖和多酚类杂质)2)本实验所使用的 marker 的在理论上应分离出 7 个 DNA 条带，而我组的 maker 只出 现6个DNA条带，经分析，可能是由于我组所加的maker量过多，导致其不能完全分离7.2 实验反思与总结(1) DNA是进行生物学研究的基础，而DNA的提取技术研究生物体DNA的关键技术 然而植物的组织中含有较高的蛋白质、多糖及多酚等干扰物质，不利于DNA的提取通过 查询文献，我们得知以下几种方法可提高提取DNA的浓度：① 尽量使用新鲜幼嫩的植物组织；② 采集的样品有液氮保存以减少DNA的降解；③ 提取较老织物组织时，可适量加大B-巯基乙醇的用量。

2) 通过本次实验，我深刻的体会到科学实验是对严谨性要求极高的过程，每一步的实验 操作的不当都可能导致实验的失败同时，在实验开始前应充分预习，提高效率的同时规避 一些可避免的不当操作。