植物脱毒程序及技术要领.pdf

中 草 药 的 脱 毒 培 养 技 术自 Movel 和 Matin 首次成功地把茎尖组织培养脱毒应用于大丽菊以来，该项技术已经在控制植物病毒方面得到应用，目前已有50 多种植物应用此法脱病毒成功在中草药农业生产中， 病毒病的危害是影响药用植物产量和质量的重要因素，有些中草药品种特别是以无性繁殖为主要方式的植物品种，因在自然环境中长期经受各种植物病毒病的重复传染而导致光合作用的明显降低，生产势变弱，品种变劣，种性退化，产量降低迄今为止，我国已经报道的药用植物病毒病有地黄病毒病、浙贝黑斑病毒、曼陀罗花叶病、八角莲花叶病、 唐菖蒲花叶病毒、独角莲皱缩花叶病、太子参花叶病等10 余种由于病毒病的危害，一般减产幅度在30%以上，成为药材生产上的重要障碍对于病毒病，目前尚无有效的防治措施，为解决这一难题，科学工作者利用植物茎尖分生组织的脱毒培养，可以成功地获得脱毒苗，有效地去除特定病毒，研究出脱毒种苗， 克服了病毒病的危害，恢复了植物固有的优良性状，再通过组织培养克隆繁殖就可以获得大量脱毒优良种苗，供生产上应用 脱毒种苗是指用生物技术结合现代血清学理论，有选择性的将植抹体内的病毒进行有效脱除，并在隔离条件下生产出的无病毒种苗。

在生产中其具体表现为：生长健壮，抗病性强，经济产量高，品质优良2.2.1茎尖培养脱毒的理论基础茎尖培养脱毒是以茎尖为材料, 在无菌条件下培养?茎尖培养之所以能够获得脱毒苗, 是由于病毒在植物体内分布不均匀, 在受传染的植物中顶端分生组织一般是无毒的?植株生长茎尖距离加大, 病毒数量逐渐增加, 这是因为植物体内病毒靠维管束系统移动?分生组织中没有维管束存在 , 病毒只靠细胞之间的胞间连丝移动, 这种移动速度很慢, 难以追上生长活跃的分生组织 ?另外 , 分生组织中旺盛分裂的细胞, 又有很强的代谢活性, 使病毒难以复制?甚至有人提出 , 在分生细胞中由于病毒钝化系统和高水平内源生长素的存在, 也抑制了病毒的增殖?感染病毒的植株体内病毒分布并不均匀，病毒的数量随植株部位与年龄而异，顶端分生组织区域一般是无病毒的或只携带浓度很低的病毒分生组织可逃避病毒侵染的可能原因是: ①病毒在植物体内的转移是通过维管束系统完成的，在分生组织区域内没有维管束组织，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞的不断分裂和活跃的生长速度; ②在分裂旺盛的分生组织内， 病毒的复制受到旺盛代谢活动的限制；③在植物分生组织区域内， “病毒钝化体系”的活性较其他部位的活性高；④ 茎尖分生组织内高浓度的植物内源激素可能会抑制病毒的增殖。

由于生长点病毒的数量极其微小，几乎检测不出， 因此利用茎尖分生组织培养脱毒苗时，在保障成活条件下，切取的茎尖越小带有病毒的可能性就越小茎尖分生组织培养除了去病毒外，尚可除去其他病原体，如细菌、真菌及类菌质体类菌质体为最小最简单的可自行复制的原核生物不同病毒在感病植株上的分布不同,因而进行茎尖脱毒培养所用的材料也各不相同?有的是顶端分化组织?有的则是茎尖?顶端分生组织,一般是指幼小叶原基以上的部分,最大长度只有 250μm 左右 ?在培养过程中 ,由于取材过小而很难剥离,即使剥离成功也很难培养成活?茎尖则是由顶端分生组织及其下方的1~3 个叶原基构成,一般大小在0.1~1mm 之间 ,剥离与培养均比顶端分生组织容易?当然以上操作均需在解剖镜下完成,同时应注意因操作不当而引起的病毒传播 ?目前大多脱毒培养所用的茎尖在0.1~1mm 之间 ?2.2.2 茎尖培养脱毒苗的方法已知大多数作物， 尤其是无性营养繁殖作物，供体都可能感染一种或几种病毒或类病毒，现已发现的病毒在500 种以上，长期无性繁殖致使病毒积累是长期低产和品质不佳的主要原因由于无病毒种苗的生产效益较高，农业对无病毒种苗需求日增，随着快繁去病毒和病毒鉴定技术的发展， 利用茎尖分生组织培育的无病毒优质种苗已广泛应用于花卉、果树、蔬菜、林木和药用植物。

世界上许多国家和地区都已有大规模成批量的工厂化生产的无性系的快繁与脱毒种苗， 这些种苗已经在植物病毒病防治、品质改善、 提高产量等方面发挥了重要作用除去植物体上的病毒大体上需经历以下四个过程：诊断、脱毒、复查、繁殖等四个环节2.2.2.1 诊断首先需了解治疗植株患的什么病，植物体内有哪些病原，哪几种病毒， 也就是说对植物病毒病原的鉴定 植物病毒病的症状与病变是识别和鉴定病害的基础植物受病毒危害后在侵染组织的细胞内发生病理学变化，用解剖学方法可以检查出来的称为病变，即内部症状然后逐渐在外部表现出来的形态特征称为外部症状外部症状依据在叶片等组织上的分布情况，可分为局部症状和系统症状局部症状是指将病毒接种植物叶片后，病毒沿侵染点周围产生斑点， 分担绿斑、坏死斑、环斑系统症状是指病毒便染寄主后能够在整个植株中运输并产生危害，在叶片、茎扦、果实等组织系统产生症状1) 植物受病毒危害后的外部症状①对植株大小的影响病毒侵染后常引起植株变小，加矮缩、矮化、丛簇和扭曲，有时病毒侵染后不表现明显症状．称为潜伏侵染 植株矮化常减少叶片大小、叶间距及叶片数目，也可能引起果实种子变小，其原因是由于细肋分裂减少、生长缓慢所引起的。

②花叶病毒侵染后引起叶片不均匀褪绿称为花叶症状当叶肉组织出现不均匀褪绿对称为驳斑，仅叶脉扭色对称为明脉花叶是引起作物产量和质量损失的主要原因③黄化病毒侵染寄主后引起叶片颜色变黄为黄化症状黄化不象花叶那样普通，如糖甜菜花叶病、小麦黄化叶病，病毒侵染后叶脉透明及黄化一些支原体也能引起黄化症状，如紫苑黄化支原体④环斑及蚀纹症状在许多病毒病中比较常见，叶片有环纹症状， 可分为单环纹或双环纹，称为环斑 叶片出现不规则线纹症状称为蚀纹如烟草环斑病毒产生环斑，烟草蚀纹病毒产生蚀纹⑤坏死是指组织、器官及整个植物的坏死，如烟草坏死病毒PVX和 PVY也能引起坏死当病毒侵染寄主后，坏死很快传播到生长点细胞，且被杀 接着整个叶片萎蔫死亡TMV和 CMV 混合感染西红柿后植株顶端坏死，叶片变小⑥畸形病毒侵染后引起寄主不正常发育，称为畸形加伤瘤病毒(WTV)侵染白三叶草在茎部产生瘤状物；豌豆耳突花叶病毒(PEWV) 侵染豇豆产生耳突还有叶片蕨叶、扭曲、卷叶、皱缩2) 植物受病毒危害后的内部症状内部症状是指病毒侵染植物后引起的宏观症状所反应的植物体内细胞的变化，包括以下几种：①坏死细胞坏死是一种主要病害，坏死可能出现在特定组织，如叶片、 根茎、 果实等。

如莴苣花叶病毒(LMV)能引起表皮细胞坏死；而烟草坏死病毒则引起根部细胞坏死；马铃薯卷叶病毒侵染马铃薯后韧皮部细胞被杀死，在韧皮部内逐渐扩大传导，但不会传给别的组织②发育不全花叶叶片通常在黄色部分表现发育不全，绿色区域叶片细跑形态正常，细胞质无太大的变化黄色区域的基质片层比绿色区域薄，薄壁细胞也很少，黄色区域细胞形态变为圆球状， 细胞质少， 液泡增大 如苹果茎沟病是由苹果茎沟病毒(ASGV)引起幼苗感染病毒．影响细胞生长发育，表现为植株矮小、不结实等现象③增生表现为细胞增大，产生明脉症状或形成层细胞不正常分裂，产生肿枝现象2.2.2.2 脱毒根据存在病毒种类，采用合适的脱毒方法，可采用热处理脱毒、茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒、 茎尖微体嫁接脱毒、珠心胚培养脱毒等，也可用热处理与组织培养相结合的方法进行 在此， 我们主要介绍在生产实践上常用的、与组织培养有关的热处理消除病毒和通过茎尖培养脱毒的一般方法1）通过热处理消除病毒所谓热处理，又称温热疗法(thermotherapy) ，长期以来，在各种植物中为了受浸染的个体得到无病毒植株， 一直有效地使用着温热疗法通过热处理消除病毒所依据的基本原理是，是将植物组织置于高于正常温度的环境中，组织内部的病毒受热以后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害?处理温度的时间因植物种类和器官的生理状况而异，一般为 35～40℃，短则几十分钟，长可达数月。

植物生长区与热处理区关系如图3-2所示图3-2 植物生长区与热处理关系图解在热处理中 B~C区是关键，在寄主热死点（C）和寄生物热死点（B）之间的距离越大，热疗法成功的机会就越大在热处理期间， 寄主植物对于病毒在活体中的钝化似乎也起某种作用热处理可通过热水或热空气进行热水处理对休眠芽效果较好；热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，既能消除病毒， 又能使寄主植物有较高的存活机会热空气处理比较容易进行：把旺盛生长的植物转移到一个热疗室中，在35~40℃下处理一定时间即可；处理时间的长短， 可由几分钟到数周不等热处理后要立刻把茎尖切下来嫁接到无病的砧木上去热处理时最初几天空气温度应逐步增高，直到达到要求的温度为止若钝化病毒所需要的连续高温处理会伤害寄主组织，则应当试验高低温交替的效果在热处理期间， 应保持适当的湿度和光照应用温热疗法消除病毒的一个主要限制在于，并非所有的病毒都对热处理敏感，例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒（leaf of virus ）一般来说，对于等径的线状的病毒， 以及对于已知是由菌类质体引起的病害，热处理是有效的延长寄主植物的热处理时间，也可能会钝化植物组织中的抗性因子，因而和对照相比会降低处理效果。

此外热处理之后，有一小部分植株能够存活和单独采用温热疗法相比，茎尖培养具有更广阔的适应性很多不能用单独的热处理消除的病毒可以通过茎尖培养和热处理相结合，或单独茎尖培养而消除因而茎尖培养现已成为消除病毒的一个很常用的手段目前，对带病毒种苗或繁殖材料通过热疗钝化、茎尖脱毒，在防止重新侵染条件下繁殖无病毒种苗，是解决由种苗传带病毒的根本措施2）通过茎尖培养消除病毒在应用组织培养方法以获得无病原菌植株时，所用的外植体可以是茎尖（shoot tip ，meristem tip ， shoot apex），也可以是茎的顶端分生组织（apical meristem， apical dome）在这里顶端分生组织是指茎的最幼龄叶原基上方的一部分，最大直径越为 100μ m 最大长度约250μm茎尖则是由顶端分生组织及其下方的1~3个幼叶原基一起构成的虽然通过顶端分生组织培养消除病毒的机会较高，但大多数已报道的工作中，无病毒植物都是通过培养100~1000μm长的外植体得到的，即通过茎尖培养得到的①脱毒的技术程序如前所述， 病毒在植物体内的分布是不均匀的一般地顶端分生组 织细胞分裂的速度较快，超过了病毒的繁殖速度，因此， 顶端分生组织不带病毒，或病毒数量极少，只要在解剖镜下，将一定大小的茎尖分生组织剥取下来，进行离体培养，即可获得无病毒植株。

脱毒的一般技术程序如图3-3所示图3-3 茎尖脱毒的技术程序②茎尖脱毒的技术要领茎尖脱毒需要掌握以下四个要领：第一，茎尖的剥取将消毒后的材料放置在解剖镜下，用解剖针（或刀）将分生组织剥取下来， 迅速放入茎尖培养基中，如果在空气中暴露时间过长，就会因失水引起茎尖死亡剥取茎尖的基本原则是既要脱掉病毒，又要使茎尖较容易成活，一般0.1~1mm 之间为宜有人实验证明以 0.2~0.5mm，带有一个叶原基的茎尖，脱毒效果最好， 成活率也最高， 可达 95%以上一般说来，离体茎尖越大，越容易成活，但病毒越难根除，只有没有输导组织的幼嫩分生组织，才可能完全没有病毒，因而，茎尖脱毒培养时，必须尽可能去除输导组织第二，选用合适的培养基和生长因子茎尖剥离下来后，只有培养于具有合适生长激素的培养基中才能成活，一般采用低激素浓度的固体培养基以大蒜为例， 茎尖培养可分为两个环节，首先以茎尖成活为目标，培养基为MS+0.5mg/L BA+0.2mg/L NAA，然后再考虑脱毒苗增殖当茎尖成活并长到2~3cm后，将其转移到增殖培养基中进行苗的伸长和分蘖，以提高繁殖系数第三，脱毒苗的移栽脱毒苗的移栽一般使用的基质有珍珠眼岩、蛭石、壤土和泥沙的混合物等， 对于大多数植物而言，幼苗生长健壮， 并有良好的根系， 移栽的成活率也较高。