齐墩果酸乌苏酸积雪草酸护肝及抗氧化作用的比较研究.doc

1齐墩果酸乌苏酸积雪草酸护肝及抗氧化 作用的比较研究作者：汤新慧, 严丽芳, 徐力致, 高静【摘要】 目的研究比较 3 种五环三萜化合物齐墩果酸(OA)、乌苏酸(UA)、积雪草酸(AA)的护肝及抗氧化作用方法建立小鼠 D-氨基半乳糖/脂多糖(D-GalN/LPS)肝损伤模型，检测 OA、UA、AA 对损伤小鼠血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性以及肝组织脂质过氧化的影响;运用体外自由基清除试验，测定 3 种化合物对超氧阴离子和羟自由基的清除作用结果 100 mg·kg-1 OA、UA、AA 均能有效抑制 D-GalN/LPS 引起的小鼠血清 AST 及 ALT 活性的显著上升;明显减少肝组织脂质过氧化产物 MDA 的生成;一定浓度 3 种化合物能有效清除超氧阴离子和羟自由基，且 3 个化合物清除自由基能力存在显著差异结论 3 种五环三萜化合物 OA、UA、AA 均具有显著护肝和抗氧化活性，且 AA、UA的护肝作用优于 OA，其机理可能与其具有更强的清除自由基能力有关 【关键词】 齐墩果酸; 乌苏酸; 积雪草酸; D-氨基半乳糖/脂多糖; 抗氧化作用Abstract：ObjectiveTo compare the hepatoprotective and anti-oxidative effects of three pentacyclic triterpenoids, oleanolic acid(OA), ursolic acid(UA) and asiatic acid(AA). MethodsD-GalN/LPS-induced liver injury model was used to evaluate the effects of OA, UA and AA on the activities of serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) and the level of liver lipid peroxidation in mice. Scavenging activity on superoxide anion and hydroxyl radicals of three compounds were investigated to determine their anti-oxidative effects.ResultsPretreatment with 100 mg·kg-1 OA, UA and AA, dovusly reversed the increase of serum AST and ALT activities and the level of liver lipid peroxidation induced by D-GalN/LPS in mice. OA, UA and AA, at concentrations ranging from 50 to 450 mol·L-1, showed dose- dependent superoxide anion and hydroxyl radical scavenging activity. In addition, it was also found that there were differences among three compounds in scavenging 2activity on free radicals, anti-oxidative and hepatoprotective effects. Conclusion Three pentacyclic triterpenoids, OA, UA and AA, have significant hepatoprotective activity against D-GalN/LPS-induced liver injury in mice. Moreover, the hepatoprotection and anti-oxidation of UA and AA are stronger than that of OA and the mechanisms might be related to their more powerful scavenging activities on free radicals.Key words：Oleanolic acid (OA); Ursolic acid (UA); Asiatic acid (AA); D- Galactosamine; Lipopolysaccharide; Anti-oxidation五环三萜类化合物分布广泛，资源丰富，毒性较低，具有广泛的药理作用和重要的生物活性，尤其在抗炎、护肝、抗肿瘤以及机体免疫调节等方面已经显现出令人关注的药理特性。

其中以齐墩果酸(OA)研究最为清楚，作为抗肝炎药物亦早已应用于临床乌苏酸(UA)为 OA 的同分异构体，现代药理学研究发现，UA 不仅具有 OA 相同的生物学作用，而且在防治肝炎、抗肿瘤等方面比 OA 的作用更强大[1，2]积雪草酸(AA)为 OA、UA 的结构类似物，除具有刺激胶原合成、抗炎、增强认知、抗肿瘤[3]等药理作用外，我们近期的研究首次发现其具显著抗肝损伤作用[4]本研究拟运用 D-氨基半乳糖/脂多糖(D-GalN/LPS)小鼠急性肝损伤和体外自由基清除试验，比较 OA、UA 及 AA 的护肝及抗氧化作用，为更好地开发利用五环三萜化合物提供依据1 材料与仪器1.1 动物 ICR 小鼠，雄性，体质量 18～22 g，购自南京医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(苏)2002-00311.2 试剂齐墩果酸，中国药品生物制品研究所产品;乌苏酸、积雪草酸，Sigma-Aldrich 公司产品;联苯双酯(DDB)，北京协和制药厂产品D-氨基半乳糖、脂多糖、3黄嘌呤、四唑氮蓝、细胞色素 C、黄嘌呤氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)，Sigma 公司产品天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、丙二醛(MDA)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所产品。

其余试剂均为国产分析纯1.3 仪器 Hitachi 7600-020 全自动生化分析仪，日立公司产品;7520 分光光度计，上海分析仪器厂产品; Biofuge Primo R 冷冻离心机，Kendro 公司产品;电热恒温水浴锅，北京市医疗设备厂产品2 方法2.1 D-GalN/LPS 急性肝损伤模型的建立小鼠分 6 组：正常组、D-GalN/LPS 损伤组、OA、UA、AA 组和阳性对照组正常组和损伤组小鼠以 0.2 ml·(10 g)-1 体质量生理盐水连续灌胃 5 d，OA、UA、AA 组以及阳性对照组分别以 100 mg·kg-1 3种化合物及 200 mg·kg-1DDB 同样方式灌胃;第 6 天正常组小鼠按 0.2 ml·(10 g)-1腹腔注射生理盐水，其余组小鼠腹腔注射 600 mg·kg-1 D-GalN;1 h 后，除正常组小鼠腹腔注射 0.2 ml·(10 g)-1 生理盐水外，其它各组腹腔注射 LPS(10 g·kg-1)，同时小鼠给予禁食不禁水LPS 注射 12 h 后，取血，分离血清，待测血清 ALT、AST活力处死小鼠后，取部分肝组织，制备肝组织匀浆，待测脂质过氧化水平。

2.2 酶活力的测定分离得到的各组小鼠血清，全自动生化分析仪测定血清ALT 及 AST 活性2.3 脂质过氧化水平测定制备的肝组织匀浆，妥巴比法测定脂质过氧化水平2.4 超氧阴离子清除实验利用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧自由基发生系统测定化合物对超氧阴离子的清除率[5]实验分为 11 组：对照组，OA 三个剂量组4(50，150，450 mol·L-1)，UA 的三个剂量组(50，150，450 mol·L-1)，AA 三个剂量组(50，150，450 mol·L-1 )，阳性对照组在 3 ml 的 10 mmol·L-1 KH2PO4-KOH 缓冲液 (pH 7.4)中加入相应浓度 3 种化合物、100 mol·L-1 黄嘌呤及 0.02 U·ml-1 黄嘌呤氧化酶，加入 100 mol·L-1 四唑氮蓝，于 25℃条件下孵育 5 min，于 550 nm 处测定吸光值，以 100 mol·L-1 SOD 作为阳性对照超氧阴离子清除率计算公式：(△AControl-△ADrug) /△AControl×100 %，△A=A0 min-A5 min2.5 羟自由基清除试验利用 CuSO4/细胞色素 C 自由基发生系统检测化合物对羟自由基的清除率[6]。

实验分组同“2.4”项在 3 ml 的 0.15 mmol·L-1 磷酸缓冲液(含 100 mol·L-1 维生素 C、100 mol·L-1 CuSO4 及 100 mol·L-1 细胞色素 C，pH 7.4)中加入相应浓度 3 种化合物，反应体系于 25 ℃中孵育 90 min，于 550 nm 处测定吸光值，以 60 mol·L-1 维生素 E 作为阳性对照羟自由基清除率计算公式：(△AControl-△ADrug) /△AControl100 %，△A=A0 min-A90 min2.6 统计方法进行单因素方差分析(one way analysis of variance, one way ANOVA)，各处理组的组间差异采用 SNK-q(Student Newman Keuls-q)检验进行比较 3 结果3.1 对 D-GalN/LPS 诱导的小鼠急性肝损伤酶活力及肝组织脂质过氧化水平的影响由表 1 可看出，D-GalN/LPS 损伤小鼠血清 ALT 及 AST 活性急剧升高，而预先予 100 mg·kg-1 的 3 种化合物灌胃的小鼠血清 ALT 及 AST 活性均显著低于损伤组，OA、UA、AA 对血清 ALT 活性升高的抑制率分别为 71.6 %，88.4%和 100 %;对血清 AST 活性升高的抑制率分别 68.3%，84.7%和 95.6%。

比较 3 种化合物的护肝作用，发现其降酶效果存在显著差异：AA 对损伤小鼠血清 ALT 酶活的抑制作用强于 UA，而 UA 强于 OA(P0.01); AA 和 UA 对损伤小鼠血清 AST5酶活的抑制作用强于 OA(P0.01)小鼠 D-GalN/LPS 损伤后，肝组织脂质过氧化水平升高为正常小鼠的 2.9 倍，表明产生了肝组织的氧化损伤而与损伤小鼠相比，预先以 3 种不同化合物灌胃给药的小鼠肝组织 MDA 水平有不同程度下降，OA、UA、AA 对损伤引起的肝组织脂质过氧化水平升高的抑制率分别为 63.5 %，83.8 %和 91.5 %，其中 AA、UA抑制作用强于 OA(P0.01)3.2 对超氧阴离子的清除作用对超氧阴离子的清除试验结果(表 2)显示，3 种化合物对超氧阴离子有明显的清除作用，并且随着浓度的增加，其清除作用随之加强比较相同浓度不同化合物对超氧阴离子的清除作用发现，AA、UA 的清除能力超过了相同浓度的 OA，450 mol·L-1AA 对超氧阴离子的清除率(55.5%)及UA(49.4 %)与同浓度 OA(40.4%)相比均有显著差异(P0.01)表 1 OA、UA、AA对小鼠酶活力及肝组织脂质过氧化的影响表 2 OA、UA、AA 对超氧阴离子的清除作用3.3 对羟自由基的清除作用由表 3 可知，150 及 450 μmol·L-1 3 种化合物对羟自由基具有显著清除作用。

比较其对羟自由基的清除能力发现，3 种化合物对羟自由基清除能力有显著差异， OA，UA、AA(450 μmol·L-1)对羟自由基的清除率分别为 41.8 %、50.。