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第十二章　固相膜免疫测定第一节　概述　　固相膜的特点在于其多孔性、非共价键高度吸附抗体或抗原和易于漂洗等，固相膜像滤纸一样，可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行 　　标志物可用酶或各种有色微粒子，如彩色胶乳、胶体金或胶体硒 　　一、常用的固相膜　　固相膜免疫测定中常用的膜为玻璃纤维素（fiberglass）膜、尼龙（nylon）膜、聚偏氟乙烯（PVDF）膜和硝酸纤维素（NC）膜等其中最常用为NC膜 　　二、固相膜的技术要求　　1.孔径 　　2.流速 　　3.蛋白质结合力 　　4.均一性 　　 第二节　免疫金标记技术 　　免疫金标记技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标志物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测 　　一、胶体金的制备　　（一）制备原理　　胶体金的制备一般采用还原法，常用的还原剂有枸橼酸钠、鞣酸、维生素C、白磷、硼氢化钠等 　　（二）技术要点　　枸橼酸三钠还原法制备金溶胶，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535nm金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化。

　　（三）注意事项　　1.玻璃容器的清洁 　　2.试剂、水质和环境 　　二、免疫金的制备　　（一）制备原理　　免疫金是指胶体金与抗原或抗体等大分子物质的结合物，在免疫组织化学技术中，习惯上称之为金探针制备原理为蛋白质被吸附到胶体金颗粒表面而结合的过程　　（二）技术要点　　1.胶体金溶液的pH 　　2.蛋白质最适标记量　　（三）注意事项　　多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂 　　 第三节　膜载体免疫测定的种类与原理 　　一、免疫渗滤试验　　免疫渗滤试验（IFA）用于检测各种传染病的抗体和肿瘤标志物等用于检测尿液HCG的“金标”早孕诊断试剂也已广泛应用 　　（一）原理　　斑点金免疫渗滤试验（DIGFA）是将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，制成抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上，依次在膜上滴加标本、免疫胶体金及洗涤液等试剂并与硝酸纤维素膜上的相应抗体或抗原发生反应，过量试剂很快渗入吸水材料中 　　抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红色斑点液体通过微孔滤膜时，渗滤液中的抗原或抗体与膜上的抗体或抗原相接触，起到亲和层析的浓缩，达到快速检测的目的，同时洗涤液的渗入在短时间内即可达到彻底洗涤的目的，简化了操作步骤，成为床边检验（POCT）的主要方法之一。

　　（二）方法类型　　1.双抗体夹心法 　　2.间接法测特异性抗体 　　（三）实验材料　　1.滴金反应板 　　2.胶体金标志物 　　3.洗涤液 　　4.抗原参照品或抗体阳性对照品 　　（四）技术要点 　　1.上样 　　2.滴加胶体金标记抗体　　3.滴加洗涤液2～3滴　　4.结果观察 在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点者判为阳性反应，反之则为阴性反应斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度 　　二、免疫层析试验　　（一）原理　　金免疫层析试验是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术　　（二）方法类型　　1.双抗体夹心法测抗原　　2.竞争法测小分子抗原　　3.间接法测抗体　为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法　　（三）实验材料　　临床上有现成试剂盒供应，试剂盒主要成分为胶体金层析条，所用试剂全部为干试剂，它们被组合在一试剂条上，试剂条的底板为单面胶塑料片，层析条为多孔聚乙烯、硝酸纤维素、玻璃纤维素材料，A、B两端粘贴吸水性强的滤纸等材料　　（四）技术要点　　1.将试剂条标记线一端浸入待测标本中2～5秒或在标本加样处加一定量待检标本，平放于水平桌面上。

　　2.在5～20分钟内观察结果 　　3.结果判断　　阴性为出现1条棕红线质控条带；阳性为出现2条棕红线条带；无棕红线条带出现为试剂失效 　　（五）临床应用　　1.正常体液中不存在的物质（如传染病抗原和抗体以及毒品类药物等） 　　2.正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如HCG等）的检测 　　三、斑点酶免疫吸附试验　　斑点酶免疫吸附试验（Dot-ELISA）的实验原理与常规的ELISA相同，不同之处在于斑点-ELISA所用载体为蛋白质具有极强吸附力（近100%）的硝酸纤维素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色 　　实验方法为：加少量（1～2μl）抗原于膜上，由于NC膜吸附能力强，故需在干燥后进行封闭；然后滴加样品血清，其中的待检抗体即与NC膜上抗原结合；洗涤后再滴加酶标二抗，最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液（如HRP标志物，常用二氨基联苯胺）；阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色斑点 　　优点为：NC膜吸附蛋白力强，微量抗原吸附完全，故检出灵敏度可较普通ELISA高6～8倍；试剂用量较ELISA节约约10倍；操作简单，实验及结果判断不需特殊设备条件；吸附抗原（抗体）或已有结果的NC膜可长期保存（－20℃可长达6个月），不影响其活性。

　　四、酶联免疫斑点试验　　体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试验（ELISPOT） 　　（一）ELISPOT原理　　细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合BCIP／NBT底物孵育后，PVDF膜出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果 　　（二）ELISPOT特点　　1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量 　　2.ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率 　　3.由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万～30万个细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞 　　4.捕获抗体为高亲和力、高特异性和低内毒素McAb，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

　　ELISPOT技术应用领域非常广泛，如移植中排斥反应的预测、疫苗发展、Th1／Th2分析、自身免疫病研究、肿瘤研究、过敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原决定簇图谱分析、化合物和药物免疫学反应的筛选等 　　五、免疫印迹法　　（一）原理　　1.抗体的性质　影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合，多数多克隆抗血清中或多或少地含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹实验中常选用多克隆抗体 　　第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）　　第二阶段为电转移此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见　　第三阶段为酶免疫定位将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色　　常用的HRP底物为3，3，-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）阳性反应的条带清晰可辨并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。

　　（二）免疫印迹中需要注意的问题　　1.抗体的性质　影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合，多数多克隆抗血清中或多或少地含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹实验中常选用多克隆抗体　　2.IBT的灵敏度　　　3.IBT法在临床中的应用　　　本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断 　　六、放射免疫沉淀试验　　放射免疫沉淀试验（RIPA）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法，同时弥补了免疫印迹法的不足。