生物化学简明教程第四版03蛋白质化学.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,*,,,单击此处编辑母版标题样式,*,1,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,,,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,*,1,,2,第2章 蛋白质化学,主要介绍氨基酸、肽和蛋白质的结构、性质、功能以及蛋白质的结构与功能的关系还介绍了一些基本技术如氨基酸的分离、纯化，多肽的人工合成，蛋白质的分离、纯化、鉴定等主要内容：,,3,元素组成,所有蛋白质都含有 C、H、O、N 四种元素，大多数蛋白质还含有少量的 S，有些蛋白质还含有一些其它元素，如 P、Fe、Cu、Mo、I等各种蛋白质的含氮量都很接近，都在,16%,左右，因此可通过测定生物样品中的含氮量计算出样品中蛋白质的含量，,1克氮就相当于,克,蛋白质4,蛋白质分子的大小,,蛋白质,：,6 000～10 000 000,,肽,：,<6 000,,,构成蛋白质氨基酸平均分子量,128,，氨基酸残基平均质量为,110.,5,2.1.,1,根据蛋白质分子的形状,（,1）球状蛋白质（globular protein）,（,2）纤维状蛋白质（fibrous protein）,2.1 蛋白质的分类,6,（3）膜蛋白质（Membrane protein）,7,2.1.2,根据组成和溶解度,（,1）单纯蛋白质: 完全由氨基酸组成的蛋白质。

根据溶解度的不同）,清蛋白：溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液球蛋白：不溶于水而溶于稀盐溶液谷蛋白：,醇溶谷蛋白：,精蛋白：,组蛋白,硬蛋白,,,8,(2)结合蛋白质：由蛋白质和非蛋白质两部分组成根据非蛋白质即辅基的不同）,(2) 糖蛋白（,糖蛋白和蛋白聚糖,）：含糖类，如胶原蛋白3) 脂蛋白：含脂类，如血浆脂蛋白4) 色蛋白：含金属，如血红蛋白1) 核蛋白：含核酸，如核糖体5) 磷蛋白：含磷酸，如酪蛋白9,（1）,酶,， 生物体新陈代谢在酶的催化下进行2）,调节蛋白,，如激素蛋白，基因调节蛋白3）,贮存蛋白质,， 如卵清蛋白，种子蛋白和铁蛋白4）,转运蛋白,， 如血红蛋白和膜转运蛋白5）,运动蛋白,， 如肌动蛋白和肌球蛋白6）,防御蛋白和毒蛋白,，如抗体和毒素7）,受体蛋白,，如激素受体8）,支架蛋白,，如导向蛋白9）,结构蛋白,，α-角蛋白10）,异常功能蛋白,生命现象的具体体现者和生物功能的具体执行者2.1.3,依据生物功能分类,10,11,蛋白质水解：用酸、碱或酶将蛋白质彻底水解，可以得到许多种氨基酸的混合物，说明氨基酸是蛋白质的基本结构单位蛋白质水解产物中分离出来的常见氨基酸只有,20种,。

蛋白质的化学概念,1、蛋白质,——,由,20种,α-氨基酸,通过,肽键,相互连接而成的一类具有特定,空间构象,和,生物学活性,的高分子有机化合物12,2.2 蛋白的组成单位----氨基酸,2.2.1,氨基酸的通式(p21),或,13,氨基酸的构型、旋光性和光吸收,构型：,,组成蛋白质的氨基酸除,Gly,以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为,D-型,和,L-型,14,丙氨酸的两种立体异构体,15,旋光性：,组成蛋白质的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子， 所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用,“,一,”,号表示，向右旋转的称右旋，用,“,＋,”,号表示16,蛋白质中常见,L-型氨基酸的比旋,17,18,一氨基一羧基氨基酸,,2.2.,2 常见氨基酸的结构、缩写符号和分类,（,1）根据R基团的化学结构：脂肪族、芳香族、杂环族,①脂肪族,19,一氨基一羧基氨基酸,20,21,22,23,②芳香族氨基酸,24,③杂环氨基酸和亚氨基酸,25,26,(2) 按R基的酸碱性质,27,(3) 按侧链R基的极性,非极性,R基团氨基酸,,不带电荷极性,R基团氨基酸,带电荷,R基团氨基酸,31,几种重要的不常见氨基酸,从各种生物分离到的氨基酸已达,250种以上,32,非蛋白质氨基酸,33,2.2.3 氨基酸的理化性质,（1）一般物理性质,氨基酸呈无色结晶，熔点高（＞200℃），融熔时即分解。

在水中溶解度各不相同，易溶于酸或碱一般不溶于有机溶剂味感各异34,,,,,,,*,“,-,”,表示左旋，,“,+,”,表示右旋2)氨基酸的紫外吸收性质,组成蛋白质的氨基酸中，Trp、Tyr和 Phe对紫外光有一定的吸收，这是因为它们分子中含有苯环，是苯环的共轭双键造成的，这三个氨基酸的光吸收都在280nm附近35,表,1 天然氨基酸的旋光性,,,,,,,,*,“,-,”,表示左旋，,“,+,”,表示右旋36,（3）氨基酸的酸碱性质和等电点（p25）,A、氨基酸的两性离子形式,两性离子,(两极性的离子),37,B、氨基酸的两性解离和等电点,酸碱质子理论：,HA A,-,+ H,+,酸,碱,质子,38,氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质，是一类,两性电解质,39,不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在：(p25),正离子,两性离子,负离子,氨基酸所带净电荷为“零”时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（isoelectric点），以pI表示40,实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。

当溶液的,pH=pI时，氨基酸主要以两性离子形式存在pHpI时，氨基酸主要以负离子形式存在41,C．氨基酸的酸碱滴定曲线,+1,,0 -1,,正离子 两性离子 负离子,,K,1,,,,=[A,±,][H,+,],/,[A,+,],K,2,,,,=[A,-,][H,+,],,/,[A,±,],,H,+,OH,-,H,+,OH,-,甘氨酸滴定曲线,,43,Handerson-Hasselbalch公式,pH=pKa + lg,[质子受体],[质子供体],可计算出在任一,pH,条件下一种氨基酸的各种离子的比例谷氨酸（,A）和赖氨酸（B）滴定曲线,B,A,,pK,1,,,,,,,,pK,2,,pI,,pI,pK,3,pK,3,pK,2,pK,1,,,,加入的OH,-,mL数,加入的OH,-,mL数,,,pH,pH,45,D．等电点的计算(p,18,),中性氨基酸：以,Gly为例,K,1,=,[Gly,±,] [H,+,],[Gly,+,],K,2,=,[Gly,-,] [H,+,],[Gly,±,],pI时，,[Gly,+,] = [Gly,-,],[Gly,±,] [H,+,],K,1,=,[Gly,±,] K,2,[H,+,],[H,+,],2,=K,1,K,2,pH=（pK,1,+pK,2,）,/2,pI=（pK,1,+pK,2,）,/2,pI =,（,2.34+9.60,）,/2=5.97,Gly,46,酸性氨基酸，以天冬氨酸为例：,等电点（,pI）,—,相当于该氨基酸的两性离子状态两侧,,的基团,pK值之和的一半。

47,碱性氨基酸，以,Lys为例：,48,Handerson-Hasselbalch公式（p,18,）,pH=pKa + lg,[质子受体],[质子供体],可计算出在任一,pH,条件下一种氨基酸的各种离子的,比例,例如：谷氨酸的pI=3.22, pH=3.22时，谷氨酸的存在形式如下：,[Glu,+,]/[Glu,±,]=[Glu,-,]/[Glu,±,]根据公式：3.22-2.19=,lg,[Glu,±,]/[Glu,+,]，查常用对数表1.03，得到[Glu,±,]/[Glu,+,]=10.2，,[Glu,+,]/[Glu,±,]=[Glu,-,]/[Glu,±,]=0.098，,同理，3.22-9.67=,lg,[Glu,2-,]/[Glu,-,]，[Glu,2-,]/[Glu,-,]=3.5×10,-7,,49,氨 基 酸,,,pK,1,(,—,COOH),,,pK,2,(,—,NH,3,+,),,,pK,R,(R基),,,pI,,,甘氨酸,,,2.34,,,9.60,,,,,,5.97,,,丙氨酸,,,2.34,,,9.60,,,,,,6.02,,,缬氨酸,,,2.32,,,9.62,,,,,,5.97,,,亮氨酸,,,2.36,,,9.60,,,,,,5.98,,,异亮氨酸,,,2.36,,,9.68,,,,,,6.02,,,丝氨酸,,,2.21,,,9.15,,,,,,5.68,,,苏氨酸,,,2.63,,,10.43,,,,,,6.53,,,天冬氨酸,,,2.09,,,9.82,,,3.86(β-COOH),,,2.97,,,天冬酰胺,,,2.02,,,8.8,,,,,,5.41,,,谷氨酸,,,2.19,,,9.67,,,4.25（γ-COOH）,,,3.22,,,谷氨酰胺,,,2.17,,,9.13,,,,,,5.65,,,精氨酸,,,2.17,,,9.04,,,12.48(胍基),,,10.76,,,赖氨酸,,,2.18,,,8.95,,,10.50（ε-氨基）,,,9.74,,,组氨酸,,,1.82,,,9.17,,,6.00（咪唑基）,,,7.59,,,半胱氨酸,,,1.71,,,8.33,,,10.78(-SH),,,5.02,,,甲硫氨酸,,,2.28,,,9.21,,,,,,5.75,,,苯丙氨酸,,,1.83,,,9.13,,,,,,5.48,,,酪氨酸,,,2.20,,,9.11,,,10.07（-OH）,,,5.66,,,色氨酸,,,2.38,,,9.39,,,,,,5.89,,,脯氨酸,,,1.99,,,10.60,,,,,,6.30,,,,表3-3 氨基酸的解离常数和等电点(p,14,～,16,),50,（2）氨基酸的化学反应,51,①茚三酮反应,570nm检测，脯氨酸和羟脯氨酸黄色，460nm检测。

52,②,与甲醛反应,53,54,③,与2，4一二硝基氟苯的反应,DNFB,DNP,-氨基酸（黄色）,Sanger 用来鉴定多肽、蛋白质的N末端氨基酸,55,氨基酸与,5一二甲氨基萘-1-磺酰氯（DNS-Cl）的反应,1,5,二甲氨萘磺酰（DNS）基团有荧光，微量的氨基酸也可用此法测定,56,④与异硫氰酸苯酯的反应,PITC,PTC,-氨基酸,PTH,-氨基酸,Edman 用来鉴定多肽、蛋白质的N末端氨基酸,57,⑤与HNO,2,的反应,范氏,(VanSlyke ) 定氮法的原理基础；,可测定氨基酸量及蛋白质水解程度58,⑥与荧光胺反应,激发波长390nm，发射波长475nm,59,⑦与5，5-双硫基-（2-硝基苯甲酸）反应,与半胱氨酸的-SH反应，产物在波长412nm处有最大吸收峰60,（3）氨基酸的分离、分析和鉴定,①分配层析法,分配系数,Kd=,C,A,C,B,C,A,：一种物质在,A相（流动相）中的浓度,C,B,：一种物质在B相（固定相）中的浓度,,原理：主要根据被分析的样品（如,aa混合物）在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的，,61,62,A.纸层析,单向纸层析图,Rf值,63,双向纸层析图,64,B.薄层层析,65,②,离子交换层析法,,原理：,分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。

这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关66,离子交换树脂：,化学本质：是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物67,阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基,-SO3H,,（强酸型），羧基,-COOH（弱酸型）,阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基,-,,N+(CH,3,),3,OH-,68,69,茚三酮显色：仪器灵敏度,10,-9,mol,,,,,,70,71,③高效液相色谱法(HPLC),HPLC的特点:,HPLC可使氨基酸分析的灵敏度达到10,-12,mol水平72,2.3 肽,,肽是由两个或两个以上的氨基酸通过肽键连接而形成的化合物Peptide bond,2.3.1 肽的结构,73,二肽,三肽,四肽,二肽→ 十二 肽,多肽（,Polypeptide）,,十三肽→ 二十 肽 氨基寡肽,74,氨基酸之间通过肽键连接形成的链称肽链N端,氨基酸残基,氨基酸残基,C端,肽链书写方式：,N端→C端,肽链有链状、环状和分支状75,命名：根据氨基酸组成，由,N端→C端命名,丙氨酰甘氨酰亮氨酸,Ala－Gly－Leu,(or Ala•Gly•Leu),区别,：（,Ala，Gly，Leu,）,76,肽链与蛋白质之间关系,77,N、C原子sp,2,杂化，共价键同一平面图，接近120°，顺时针旋转为正，逆时针为负，N-C转角为φ，C-C转角ψ，酰胺N带0.28正电荷，羰基O带0.28负电荷。

78,结论,,,（1）肽键中的四个原子和它相邻的两个α-碳原子处于同一平面，形 成了酰胺平面，也称肽平面2）肽键的键长介于C-N单键和双键之间，具有部分（40%）双键的性质，不能自由旋转3）肽平面中羰基氧原子与亚氨基的氢原子以反式排列4）C,a,和亚氨基的N及羰基C之间的键都是单键，可以自由旋转谷胱甘肽,1、作还原剂保护蛋白质或巯基酶，或防止过氧化物积累2、GSH的巯基具有嗜核特性，与嗜电子物质（如致癌物）结合，保护DNA和RNA1）谷胱甘肽(glutathione,GSH),生物活性肽,2.3.1 生物活性肽的功能,80,（2）催产素和加压素,81,（3）促肾上腺皮质激素,,39肽，腺垂体分泌，刺激肾上腺皮质的生长和肾上腺皮质激素的合成和分泌 4）脑肽,,脑啡肽,,具镇痛作用5）胰高血糖素,,（6）胃肠道活性肽,,82,2.4.1 蛋白质的一级结构,2.4 蛋白质的结构,蛋白质的一级结构：,指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序（,sequence）氨基酸残基,氨基酸残基,N端,C端,83,84,(1)维持蛋白质构象的化学键,,氢键、离子键、疏水键、范德华引力,二硫键、配位键,2.4.2 蛋白质的空间结构,85,稳定蛋白质三维结构的各种作用力,a 离子键,b 氢键 c 疏水键 d 范德华引力 e 二硫键,86,(2)蛋白质的二级结构（P,29,）,,蛋白质的二级结构是指多肽链中的主链借助氢键，有规则地卷曲折叠成沿一维方向具有周期性结构的构象。

键长、键角、酰胺平面和两面角,早在20世纪30年代，Pauling和Corey就开始用X-射线衍射方法研究了氨基酸和肽的结构87,①α-螺旋,α-螺旋结构的俯视图,88,89,①每个φ角等于,–,57°,每一个ψ角等于-47°②主链绕中心轴按右手方向盘绕，每个氨基酸残基螺旋上升一圈，每圈螺旋的高度为，每个氨基酸残基沿轴上升，螺旋上升时，每个残基沿轴旋转100,°,,③ α-螺旋的稳定性主要靠氢键来维持氢键的取向几乎与中心轴平行，氢键是由第n个氨基酸残基的 CO 氧与第n+4个氨基酸残基的 NH 基的氢之间形成的 α-螺旋结构的要点如下：,90,除了上面这种典型的α-螺旋外，还有一些不典型的α-螺旋，所以规定了有关螺旋的写法，用“S,N,”来表示，S为螺旋上升一圈氨基酸的残基数N为氢键封闭环内的原子数，典型的α-螺旋用,13,表示，非典型的,α-螺旋有,10,，,16,（,π螺旋）等91,一些侧链基团虽然不参与螺旋，但他们可影响,α-螺旋的稳定性,1、在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸，α-螺旋就不稳定2、在多肽链中只要出现Pro，α-螺旋就被中断，产生一个弯曲或结节3、Gly的R基太小，难以形成α-螺旋所需的两面角，所以和Pro一样也是螺旋的最大破坏者。

4、肽链中连续出现带庞大侧链的氨基酸如Ile，由于空间位阻，也难以形成α-螺旋92,②,β-折叠(β-构象),也是,Pauling,等人提出来的，它是与,α-螺旋完全不同的一种结构①两条或两条以,上,肽链主链,骨架以一定的折叠形式形成一个折叠的片层在两条相邻的肽链之间形成,氢键,②,R基交替出现在片层的上方和下方③ β-折叠有平行和反平行的两种形式④ 每一个氨基酸在主轴上所占的距离，平行的是，反平行的是93,94,Ψ=135°,95,③,β-转角,β-转角是指蛋白质的分子的多肽链经常出现180,°,的回折，在回折角上的结构就称,β-转角,，也称,发夹结构,，或,称,U形回转,由第一个氨基酸残基的,C=O与第四个氨基酸残基的N,—,H之间形成氢键β-转角特点：,96,④,β-凸起,是,β,折叠股中额外插人的一个残基，它使得在两个正常氢键之间、在凸起折叠股上是两个残基而另一侧的正常股上是一个残基97,⑤,无规卷曲,无规卷曲是指没有规律性的肽链结构，但许多蛋白质的功能部位常常埋伏在这里98,（3）超二级结构和结构域,,①,超二级结构,,是指在蛋白质分子中由若干,相邻,的二级结构单元（α-螺旋、β-折叠、β-转角等）相互聚集，形成有规律的二级结构的聚集体。

已知的超二级结构主要有αα，βxβ，β-曲折和β-折叠筒等99,αα：是两个α-螺旋互相缠绕， 形成一个左手超螺旋100,βxβ：是两段平行的β-折叠通过一段连接链x连接而形成的结构如x为α- 螺旋则为βαβ；最常见的为两个βαβ聚集体连在一起形成βαβαβ结构，称Rossmann折叠βαβ,Rossmann折叠,101,如,χ为β-折叠，则为βββ如,x为无规卷曲，则为βcβ102,β xβ单元的连接方式,103,β-迂回,是三条或三条以上反平行的β-折叠通过紧凑β-转角连接而成104,β-折叠筒：,由多条β-折叠链所构成的β-折叠片，再卷成一个园筒状的结构105,106,②结构域,结构域（Structural Domain）是多肽链在,超二级结构,基础上进一步盘绕折叠成的,近似球状,的紧密结构结构域实质上是二级结构的组合体，充当三级结构的构件每个结构域分别代表一种功能混合型折叠结构,107,反平行β-螺旋结构域,α-螺旋结构域,结构域的大小,变化很大,,常见的范围在100-200个残基之间,108,卵溶菌酶的三级结构中的两个,结构域,109,木瓜蛋白酶内的,2个,结构域,110,（4）蛋白质的三级结构,,是指,球状蛋白质在,二级,结构、超二级结构和结构域的基础上，组装而成的完整的结构单元。

指一条多肽链中所有原子的空间排列抹香鲸肌红蛋白（,Myoglobin,）的三级结构,112,α-螺旋,β-折叠,β-转角,无规则卷曲,空穴,1、,含多种二级结构单元；,2、,是紧密的球状或椭球状实体；,3、,分子表面有一空穴,(活性部位)；,4、稳定性主要依靠次级键来维持，疏水作用起了很重要的作用5、疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面实例：肌红蛋白，卵溶菌酶,球状蛋白三级结构共同特征,113,（5）蛋白质的四级结构,,亚基（亚单位）,是指一条多肽链或以共价链连接在一起的几条多肽链组成的具有三级结构的亚单位,四级结构,是指亚基间通过非共价键聚合而形成特定的构象 114,一般来说亚基不具有生物活性，即使有也很小，只有当这些亚基聚合成一个完整的蛋白质分子后，才具有生物活性115,血红蛋白是由四个亚基组成，2个α-亚基，2个β-亚基，每个亚基由一条多肽链与一个血红素辅基组成 ４个亚基以正四面体的方式排列，彼此之间以非共价键相连（主要是疏水键,其次是盐键和氢键） 116,生物名称,A8,A9,A10,B30,人,猪,牛,狗,山羊,马,象,抹香鲸,免,Thr,Thr,Ala,Thr,Ala,Ala,Thr,Thr,Thr,Ser,Ser,Ser,Ser,Gly,Gly,Gly,Ser,Ser,Ile,Ile,Val,Ile,Val,Val,Val,Ile,Ile,Thr,Ala,Ala,Ala,Ala,Ala,Thr,Ala,Ser,表2-3 不同哺乳动物的胰岛素分子中的氨基酸差异,2.5 蛋白质结构与功能关系,22个氨基酸是各种生物所共有的,2.5.1 蛋白质一级结构与功能关系,（1） 种属差异,117,生物名称,和人不同的氨基酸数目,生物名称,和人不的氨基酸本数目,黑猩猩,恒河猴,兔,袋鼠,牛、猪、羊,狗,驴,马,鸡、火鸡,0,1,9,10,10,11,11,12,13,响尾蛇,海龟,金枪鱼,角鲛,小蝇,蛾,小麦,粗糙链孢霉,酵母菌,14,15,21,23,25,31,35,43,44,不同生物与人的细胞色素,c 相比较的氨基酸差异数目,35个氨基酸是各种生物所共有的,118,119,镰刀状红细胞贫血病,（2）分子病,120,121,122,123,(1)血红蛋白的结构,2.5.2 蛋白质的构象与功能关系,124,,肌红蛋白分子和,血红蛋白的,,-亚基,,myoglobin,,β,chain hemoglobin,125,变构效应（别构效应）,是指蛋白质与配基结合后构象发生改变，进而使生物活性发生改变的现象。

2)血红蛋白的变构作用和氧合曲线,126,血红蛋白中血红素辅基的结构,127,血红蛋白是由两个α-亚基和两个β-亚基组成的四聚体（α,2,β,2,），有稳定的四级结构，与氧的亲和力很弱，但当氧与血红蛋白分子中一个亚基的血红素辅基的铁结合后即引起该亚基构象的改变，一个亚基构象的改变又会引起其余亚基的构象相继发生改变，亚基间的次级键被破坏，结果整个分子从紧密的构象变成比较松散的构象，易于与氧结合，使血红蛋白与氧结合的速度大大加快Hb,的输氧功能,,Mb,的储氧功能,（3）免疫球蛋白的结构,V区：V,L,、,V,H,,可变区（V区）,：,氨基酸种类、排列顺序差异较大，构成抗体的多样性,恒定区（,C区）,氨基酸种类、排列顺序恒定,C区：C,L,、,C,H,,130,2.6 蛋白质的性质与分离、分析技术,2.6.1 蛋白质的性质,a. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定,（1）蛋白质的相对分子量,,131,,pH = pI,,净电荷,=0,pH< pI,净电荷为正,pH > pI,净电荷为负,Pr,COOH,NH,3,+,+,H,+,+,OH,-,+,H,+,+,OH,-,Pr,COO,-,NH,2,Pr,COO,-,NH,3,+,,当蛋白质溶液在某一定,pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的,等电点,（,isoelectric point，,pI,）,(2)蛋白质的两性解离和等电点,132,蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系,:,,等离子点,是蛋白质在不含其它溶质的纯水中，蛋白质所带净电荷为零时的溶液的,pH值。

等离子点是一个常数133,两性解离的应用,1、等电点沉淀,2、离子交换层析,3、电泳,,134,(3)蛋白质的变性作用,1．变性的概念和理论,,变性,是指天然蛋白质分子受理化因素的作用，有序的空间结构被破坏，从而导致蛋白质性质的改变以及生物活性的丧失，但未引起肽键的断裂，这种现象称为蛋白质的变性作用理论：吴宪提出,肽链从紧密有序结构→松散无序的结构,135,2．变性的因素,物理因素,:,加热、紫外线、X-射线、超声波等化学因素,:,酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂（尿素、盐酸胍）、重金属盐等136,,2．变性机制,物理因素：,对蛋白质施加了较高的能量，使次级键发生断裂酸碱变性：,使蛋白质分子内带大量同种电荷，盐键破坏有机溶剂变性：,影响氢键、疏水键和盐键的稳定性重金属：,与蛋白质的酸性基团生成不溶性的盐并破坏分子内的盐键和氢键变性剂：,与多肽链竞争氢键而破坏蛋白质二级结构137,3．变性的可逆性,138,4．变性蛋白质的特性,（,1）溶解度显著减小，不溶于水，在中性液中可沉淀和凝固，但溶于酸及碱液中2）生物活性全部或部分丧失（如免疫性、酶活性、氧结合能力）4）生化性质的改变（如变性蛋白质易被酶消化）,（,3）一些侧链基团暴露，可滴定基团增加。

139,(4)蛋白质的胶体性质,什么是胶体？（颗粒直径1~100nm）,蛋白质的亲水,胶体溶液,是相当稳定的，一方面由于蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围，形成“,水化层,”另一方面由于蛋白质在非等电点时带有,同种电荷,，同种电荷相斥，也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合140,(5)蛋白质的沉淀作用,①加中性盐沉淀蛋白质（中和电荷、脱水膜）,②加有机溶剂沉淀蛋白质（破坏水化层）,③加重金属盐沉淀蛋白质（中和负电荷）,④加某些酸类:苦味酸、单宁酸、三氯乙酸（,与酸结合生成难溶盐类,）,⑤热变性沉淀,141,(6)蛋白质的颜色反应,反应名称,试 剂,颜 色,反应有关基团,有此反应的蛋白质或氨基酸,,双缩脲反应,加氢氧化钠及少量稀硫酸铜溶液,紫色或粉红色,2个以上的肽键,所有蛋白质皆有此反应,酚试剂反应,Folin 反应）,碱性硫酸铜及磷钨酸-磷钼酸,,蓝色,酚基,,酪氨酸,,乙醛酸反应,乙醛酸试剂及浓硫酸,紫色,吲哚,色氨酸,坂口反应,α-萘酚,,次氯酸钠,红色,胍基,精氨酸,,米伦反应,加米伦试剂(硝酸汞、亚硝汞、硝酸和亚硝酸）,红色,酚基,酪氨酸,,茚三酮反应,茚三酮,蓝紫色,自由氨基酸及羧基,α-氨基酸,,,,,,,,,,,142,（7）蛋白质的含量测定,①考马斯亮蓝染色法,②紫外吸收法,③凯氏定氮法,143,2.6.2 蛋白质的分离和分析技术,a．盐析法,在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐，使蛋白质沉淀下来，常用的中性盐为(NH4),2,SO4、NH,4,Cl等。

1) 根据蛋白质的溶解度不同进行分离,144,b．等电点沉淀,利用蛋白质在等电点时溶解度最小这一特性，可以调溶液的pH，尽量接近它的等电点，而使蛋白质沉淀145,c．低温有机溶剂沉淀法,常用的是乙醇、丙酮146,（2）根据分子大小不同分离蛋白质的方法,,147,b.超滤,148,c．凝胶过滤,也称分子排阻层析、分子筛层析，这是根据蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法149,（3）根据电荷不同分离蛋白质的方法,,150,b．离子交换层析,离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素(CM-纤维素)，阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）151,152,1．亲和层析,这是根据蛋白质能与特异的配体相结合而设计的一种方法蛋白质 ＋ 配体 蛋白质配体复合物,（4）根据生物学特性不同分离蛋白质的方法,153,154,155,（5）根据吸附性质不同分离蛋白质的方法,吸附法是利用各种吸附剂和蛋白质结合能力（吸附能力）的不同来分离蛋白质156,2.6.3 蛋白质的一级结构的测定,,蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序和连接。

157,(1)多肽链的分离,,,,胰岛素,,,-巯基乙醇,碘乙酸,,(2)二硫键的断裂,158,(3)多肽链的氨基酸组成分析,酸水解、碱水解,氨基酸自动分析义测定,159,（4）N-端分析,① 二硝基氟苯法（DNP法、DNFB法或FDNB法）,160,② 丹磺酰氯法（DNS法）,161,③ 苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、Edman降解法 ）,162,①肼解法,（5）C-端分析,,163,（,2）C-端分析,②硼氢化锂还原法,164,③羧肽酶法,③羧肽酶A、羧肽酶B和羧肽酶C,165,（6）多肽链的部分水解,,溴化氰（CNBr）裂解法:,消化道内几种蛋白酶的专一性,,（,）,,,（,）,（脂肪族）,,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,弹性蛋白酶,羧肽酶,胰蛋白酶,,,,,,,,氨肽酶,羧肽酶,（,）?$,b.酶解方法,167,c.找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列,通过末端分析得到：,用胰蛋白酶水解得到第一套肽段，测定出氨基酸顺序用胰凝乳蛋白酶水解得到第二套肽段，测定出氨基酸顺序—,—,+,第一向,第二向,AB,一个含二硫键的肽断裂产生的肽段,,对角线电泳图解,,169,。