微生物采油菌种室内筛选与评价技术研究.doc

微生物采油菌种室内筛选与评价技术研究摘要：针对中原油田油藏的三高特点（高温、高压、高盐），应用微生物室内富集培养与分离 纯化技术，筛选出具有应用潜力的四株微生物采油菌种室内评价表明，四种微生物可耐受 90C高温、15MPa压力、lOXlO’mg/L矿化度，在液体培养过程中均能产生表面活性剂和有 机酸，CI1以下低碳烷炷不能被细菌利用对高粘度原油降粘率高达68%,低粘度原油作用 不大，最高降粘率16.1%,具有矿藏应用价值关键词：微生物采油；中原油田；菌种筛选；性能评价微生物采油技术目前在世界各国得到普遍研究与应用［⑵其主要机理是降解原油，并代 谢产生有利于提高采收率的表面活性剂、有机酸、气体等现在市场上一般采油用微生物的 适用油藏温度在40〜60C、矿化度小于5X104mg/L,不适合中原油田油藏的三高特点（地层 温度75-140C、油藏饱和压力10〜25MPa、矿化度7〜32X 104 mg/L）为此中原油田与山东 大学微生物技术国家重点实验室合作开展了适应于中原油田地质特点的采油用微生物菌种筛 选与评价工作，并获得四株具有应用价值的微生物采油菌种1微生物室内筛选与鉴定1.1菌种来源样品为73个中原油田污水、炼油厂废水样和28个含油污泥样。

1.2培养基组成与配制1.2.1分离降解石油微生物的无机盐溶液NaC10.5% , （NH4） SO40.1 % , MgSO4 . 7H2O（）.025% , NaNO30.2% , KH2PO40.5% , K2HPO4. 3H2O1.0%1.2.2以原油为碳源的液体培养基在50ml厌氧培养瓶中加入原油0.2g,按厌氧液体培养基制备方法El分装无机盐溶液 10ml, 120C蒸汽灭菌20min,然后用无菌注射器注入2mlATS溶液和0.2mll.0%Na2S和 NaHCO3 溶液1.2.3以原油为碳源的固体培养基无机盐溶液添加酵母膏0.1%,原油4.0%,琼脂2.0%,调pH值为7.0.7.2, 0.1 MPa灭菌 20mino1.2.4以葡萄糖为碳源的固堡培养基无机盐溶液添加酵母膏0.1%,葡萄糖2.0%,琼脂2.0%,调pH值为7.7.2, 0.7-0.8MPa 灭菌20mino1.2.5以葡萄糖为碳源的液体培养基无机盐溶液添加酵母膏0.2%,葡萄糖2.0%,调pH值为7.0-7.2, 0.6-0.7MPa灭菌20min 1.3厌氧菌种的富集配养与分离纯化1.3.1将适量的污水或土样及原油0.2g放入厌氧培养瓶中（每个样品做0%和10%两个矿化 度），按严格厌氧操作取适量无机盐溶液，40C或60C （下同），200〜250rpm摇床培养7天。

1.3.2 0.5ml上述培养液注入以原油为碳源的厌氧液体培养基，相同条件培养7天1.3.3对1.3.2进行NO/1离子检验叫 若有红色反应，则取其培养液0.5ml稀释到一定程度, 在葡萄糖培养基上涂布，放入真空干燥器内，真空脂密封抽真空30min,然后充入高纯氮气, 再抽真空lOmin,重复四次，使干燥器保持-0.02MPa的真空度，相同温度恒温培养3天， 1.3.4取不同形态的菌落在葡萄糖固体培养基上划线，反复抽真空充氮气，厌氧条件恒温培养 如此反复儿次，直到菌落形态一致1.3.5将划出的不同菌落在原油为碳源的固体培养基上划线，抽真空充氮气，厌氧培养7天， 所得菌落既为纯化菌种1.3.6挑取纯化的菌落分别接种在好氧、厌氧两种条件的原油液体培养基中，200〜250rpm摇床 培养，观察其原油降解的情况，将能降解原油的菌种保存在葡萄糖斜面上通过以上方法获得四株可降解原油的兼性厌氧菌种，分别是SDB-1、SDB-2、SDB-3、 SDB-4 o1.4菌种扩大培养小试研究141摇瓶实验⑴ 培养基配方的确定：采用正交实验法确定碳源、氮源、磷源的种类及浓度⑵摇瓶工艺参数的确定：固定摇瓶及装量，变换不同接种量、摇瓶转速及培养时间，进行生 长曲线的测定，进而确定摇瓶最适工艺参数。

1.4.2 10L及50L发酵罐工艺参数的确定采用德国B.Braun公司生产Biostat系列微机控制自动发酵罐10L发酵罐工艺参数参考 摇瓶工艺参数，通过分批发酵实验定时取样，测定菌数及活性，确定接种量、通气量、搅拌 转速、消沫剂浓度、培养时间等参数o 50L发酵罐工艺是在10L发酵罐工艺参数的基础上进 一步实验获得的，表1是50L发酵罐工艺参数表1 50L发酵罐工艺参数菌号接种量通气量 (v/vmin)搅拌时间 （rpm）消沫剂时间(hr)SDB-15%1:0.51600.3%20SDB-25%1:0.51600.3%20SDB-35%1:0.31000.3%20SDB-48%1:0.61800.3%2()1.5菌液活性保存研究微生物菌液要保持其活性需作到两点，一是目的菌处于休眠状态，代谢速度缓慢；二是 不能污染杂菌或即使污染杂菌也不能繁殖生长市售多种抑菌剂均可采用，但其作用于杂菌 的同时也伤害了目的菌根据SDB-1、2、3、4具有耐高盐的性能，盐比较廉价又无污染， 而普通微生物又不能适应高盐环境，设想用盐来保存菌液，并取得了成功表2是10L罐培 养所得菌液，分别添加一定浓度的保护剂（12%NaCL, 0.2%Tween）,密封置于室温环境保存, 每隔15天取样测定活菌及降粘能力。

表2发酵液保存活性检测结果时间（天）0153045607590SDB-1活菌数（IO个/ml）4.104.103.353.212.904.103.15降粘率（%）39.642.036.6038.135.231.534.6SDB-2活菌数（IO】个/ml）1.301.502.101.202.081.701.63降粘率（%）41.036.041.541.834.531.833.0SDB-3活菌数（IO个而）8.635.604.209.753.863.703.60降粘率（%）38.237.041.542.033.629.030.1SDB-4活菌数（0个/ml）1.220.950.762.121.831.201.08降粘率（%）42.645.139.837.641.036.535.41.6兼氧菌 步鉴性的1.6.1细菌的形态及培养特征⑴SDB-1细胞杆状，半固体穿刺运动，G o菌落为乳白色，葡萄糖固体平板培养24小时\菌 落大小约1.4〜1.7mm,圆形，半透明，表面光滑，略有凸起，边缘整齐，无色素⑵SDB-2为短杆菌，半固体穿刺，不运动，G o菌落很小，葡萄糖固体平板培养24小时，菌 落大小约1.0〜1.2mm,形状不规则，边缘呈曲波状，平突起，表而有皱褶，无光泽，色泽淡 黄，不透明，能产生绿色水溶性色素。

⑶SDB-3为短杆菌，单个、成对或链状存在，G半固体穿刺运动，不运动葡萄糖固体平板 培养24小时，菌落大小约1.4〜1.9mm,圆形，黄色，黏液状，边缘光滑，平凸起，表面平滑 ⑷SDB-4为短杆菌，单个、成对或链状存在，半固体穿刺不运动，G o葡萄糖固体平板培养 24小时，菌落大小约1.2〜1.7mm,黄色，圆型，边缘光滑，平凸起，表面平滑1.6.2生理生化特征SDB-1、2、3、4生理生化见表3 o表3生理生化特征生理生化特征菌种反应SDB-1SDB-2SDB-3SDB-4淀粉水解酶+—++明胶水解++++过氧化氢酶++++细胞色素氧化酶++++柠檬酸盐利用++++甲基红反应————乙酰甲基甲酸++++呵噪反应++++服维反应++++h2s气体反应一一——反硝化反应++++碳水化合物利用只氧化只氧化只氧化只氧化甘露糖++++乳糖++++果糖++++筒萄糖+WW+蔗糖+WW—注：“W”表示微弱产酸查《伯杰氏细菌鉴定手册》⑸第八版，SDB.1、2、3、4均属于假单胞菌属1.6.2菌株毒性测试经山东省卫生防疫站检测，SDB-1、2、3、4其LD50均大于10, 000mg/Kg,无毒，对 人体和环境无污染。

2与原油作用效果和油藏适应性研究2.1发酵液表面张力和有机酸测定有机酸测定采用酸碱滴定法，表面张力测定采用JzhYl-180表面张力测定仪发酵液表 面张力和有机酸测定结果见表4表4发酵液表面张力和有机酸测定项目培养前PH培养后PH20ml培养液NaOH当量数表面张力 mN/mSDB-17.64.26.0X IO；32.6SDB-27.64.24.7X10-335.7SDB-37.64.55.5X10-333.6SDB-47.64.36.0X IO，33.1结果表明四株菌培养过程中，均能产生表面活性剂和有机酸2.2菌种耐温、耐压、耐盐实验耐盐实验：菌种经活化后，接种子瓶，40C培养一天得到种子液，接入不同盐浓度的摇 瓶中，培养数天后，记数比较不同盐浓度中菌的生长情况，结果见表5表5菌种耐盐实验矿化度SDB-1SDB-2SDB-3SDB-4种子液（0）Oh8.0 X1063.2 X1065.6X1068.6X 10624h8.9 X 1087.0 X1086.5 X1081.2X109424h6.0 X1075.4X1074.3 X1077.6 X107824h2.5 X1078.6 X1062.6X 1076.5 X1061024h8.8X1064.6 X1068.0 X1065.3X106结果说明四株菌对• 10万mg/L的高盐具有耐受能力。

当盐浓度为8万mg/L时，菌种还 能增值，盐浓度升至10万mg/L时，菌种的增殖能力己很微弱了耐温耐压实验：种子液稀释三倍，添加不同营养成分加入高压容器，排净空气密封后放 入恒温水浴，调节至测定的温度和压力，比较高温、高压培养前后菌数的变化，结果见表6表6菌种耐温、耐压实验菌数常温常压90 C 15MFa90 C 20 MPa90 C 28 MPa菌种Oh菌数48h活菌数48h菌数48h菌数SDB-16.0 X 1083.2X1081.7X1050SDB-24.2 X1087.0 X1074.3 X1040SDB-37.8 X1081.6X1086.5 X1040SDB-49.0 X1062.30X1063.4X1030结果说明所筛选的四株菌能耐受90C高温和15MPa压力，高于这一压力活菌数将呈数 量级锐减，压力升至28 MPa时，菌种全部死。